[发明专利]一种牛奶致敏原的比色检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了一种牛奶致敏原的比色检测试剂盒及检测方法。一种牛奶致敏原的比色检测试剂盒，包括：能够特异性识别牛奶酪蛋白的第一抗体、能够特异性识别牛奶酪蛋白且与第一抗体结合位点不同的第二抗体、牛奶酪蛋白、纳米金溶液、AgNO3溶液、对苯二酚溶液和TMB溶液即3,3',5,5'‑四甲基联苯胺溶液。该方法具有高特异性、高灵敏度、成本低廉、易于保存等优点，其制成的牛奶致敏原检测试剂盒，可用于定量检测牛奶致敏原酪蛋白。

技术领域

本发明涉及致敏原检测领域，具体涉及一种牛奶致敏原的比色检测方法及试剂盒。

背景技术

食物过敏是人类最为常见的健康问题。牛奶富含蛋白质及多种矿物质，是婴幼儿早期接触的第一个也是最常见的食物致敏原，在儿童中发病率大约为0.3％～7.5％。目前，美国、欧盟和新西兰等国家均要求对致敏食品进行致敏原标示，以提醒消费者，避免误食。因此，致敏原含量的检测是进行过敏食品的生产、评估和标示工作的基础和首要任务。酪蛋白是引发牛奶过敏的主要致敏原之一。目前，牛奶致敏原的检测方法主要有ELISA、RT-PCR、LC-MS等技术。这些方法都需要高端仪器设备及专业人员操作，检测时间较长，操作较为复杂。由此，牛奶致敏原的检测方法有待改进。

酶是催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合体,其催化效率高、选择性强,被广泛应用于疾病诊断、临床治疗、生物传感和环境保护等领域。但是天然酶在极端条件下如强酸、强碱、高温等易失活且提取成本高,产量低,难以被用于大规模工业生产。纳米酶泛指具有酶活性的纳米材料，基于无机纳米材料的新型纳米酶具有制备简单、稳定性高、成本低廉、易于保存运输、环境耐受性高等优点，可代替传统酶应用于酶检测法，为致敏原分析领域提供一项方便快捷、稳定性好、灵敏性高且特异性强的快速检测方法。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供一种牛奶致敏原的化学发光免疫检测方法。该方法具有高特异性、高灵敏度、成本低廉、易于保存等优点，其制成的牛奶致敏原检测试剂盒，可用于定量检测牛奶致敏原酪蛋白。

一种牛奶致敏原的比色检测试剂盒，包括：能够特异性识别牛奶酪蛋白的第一抗体、能够特异性识别牛奶酪蛋白且与第一抗体结合位点不同的第二抗体、牛奶酪蛋白、纳米金溶液、AgNO3溶液、对苯二酚溶液和TMB溶液即3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液；所述第一抗体浓度为0.1～0.5μg/mL；第二抗体浓度为0.1～0.5μg/mL；牛奶酪蛋白浓度为100μg/mL；AgNO3溶液浓度为1mM；对苯二酚溶液浓度为1mM，TMB溶液浓度为40mmol/L；纳米金溶液浓度为75mg/mL，纳米金的粒径为15～20nm。

一种牛奶致敏原的比色检测方法，包括以下步骤：

a、制备纳米金-第二抗体探针：于量筒中量取48.75mL去离子水于洁净的锥形瓶中，温和搅拌下加入1.25mL 4g/LHAuCl4储备液；280℃下高温搅拌至溶液沸腾，保持沸腾2-3min后加入2.0mL 10mg/mL柠檬酸钠溶液，并增加磁力搅拌转速；待溶液颜色稳定后停止加热，并将反应完成的纳米金溶液置于磁力搅拌器上继续搅拌冷却至室温，即可制得15nm纳米金粒子溶液；将获得的纳米金溶液于室温1000rpm条件下离心10min，过滤去除部分聚集沉降的金粒子，将过滤获得的纳米金粒子溶液储存于4℃待用；吸取1mL纳米金粒子溶液于2mL离心管内，加入0.1mol/mL K2CO3溶液条件体系pH至8.5；将pH为8.6，10mmol/L的第二抗体用PBS缓冲液稀释至0.3μg/mL，加入10μL第二抗体，所述第二抗体为牛奶致敏原特异性单抗，室温下孵育60min，使得第二抗体吸附在纳米金颗粒上；加入10μL 500μg/mL BSA即牛清蛋白，室温下孵育60min，以封闭纳米金的非特异性结合位点，于4℃下10000g离心10min，小心移去上清液；用含有0.5％BSA的pH为7.4的0.5×PBS缓冲液将沉淀复溶，即得到纳米金-第二抗体探针；