[发明专利]一种卷口鱼精子冷冻保存方法

权利要求书

1.一种卷口鱼精子冷冻保存方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）精液采集：在卷口鱼繁育季节，选择性腺成熟的健壮雄性亲鱼，麻醉后用干毛巾擦干鱼体生殖孔周围水分和黏液，再沿着中线轻轻挤压腹部至生殖孔流出乳白色精液，用注射器吸取精液，防止尿液、血液和水混入，将采集的精液注入冻存管中；

（2）精液稀释：先将步骤（1）中采集到的精液与稀释液按照体积比为1:3或者1:5或者1:7的比例混合稀释得到溶液A，然后将溶液A与抗冻液按照体积比为1:1的比例混合后得到卷口鱼的精子保存液；所述稀释液为D-17稀释液，Hank’s液和鱼用任氏液中的任意一种；所述抗冻液是由以下体积分数的组分组成：10%或者20%或者30%抗冻剂，余量为稀释液；所述抗冻剂为二甲基亚砜、甲醇和乙二醇中的任意一种；

（3）精子冷冻保存：将步骤（2）得到的精子保存液注入冻存管中，再将冻存管置于在4℃下平衡30min，接着将冻存管置于液氮表面上方6cm处停留5min，然后将冻存管浸入液氮长期保存；或者将冻存管置于在4℃下平衡30min，接着将冻存管置于液氮表面上方8cm处停留5min，然后将冻存管浸入液氮长期保存；或者将冻存管置于在4℃下平衡30min，接着将冻存管置于液氮表面上方10cm处停留5min，然后将冻存管浸入液氮长期保存；

（4）精子解冻：将装有精子保存液的冻存管从液氮中取出，然后立即置于温度为37℃的水浴锅中解冻，再将解冻后的精子保存液置于4℃下保存备用。

2. 根据权利要求1所述的卷口鱼精子冷冻保存方法，其特征在于：步骤（2）中所述D-17稀释液是在每100ml纯水中加入0.9g NaCl、0.05g KCl和1.5g葡萄糖混合得到的；所述Hank’s液是在每100ml纯水中加入0.801g NaCl、0.04g KCl、0.014g CaCl₂、 0.035gNaHCO₃、0.006g KH₂PO₄和0.034 g葡萄糖混合得到的；所述鱼用任氏液是在每100ml纯水中加入0.78g NaCl、0.021g CaCl₂、0.02g KCl、0.2g NaHCO₃混合得到的。

3.根据权利要求1所述的卷口鱼精子冷冻保存方法，其特征在于：步骤（2）中所述抗冻液是置于4℃的温度下保存备用。

4.根据权利要求1所述的卷口鱼精子冷冻保存方法，其特征在于：在步骤（1）中取10微升采集的精液与等体积的质量分数为0.7%的氯化钾混合后迅速在显微镜下观察精子运动情况，选择精子活率90%以上的精液进行稀释和保存。