[发明专利]一种卷口鱼精子冷冻保存方法

说明书

本发明公开了一种卷口鱼精子冷冻保存方法，其包括精液采集、精液稀释、精子冷冻保存和精子解冻四个步骤，采用人工腹部挤压法采集卷口鱼的精液，然后将精液与稀释液混合后，再与抗冻液混合得到精子保存液，所述稀释液为D‑17稀释液，Hank’s液和鱼用任氏液中的任意一种；所述抗冻剂为甲醇、二甲基亚砜和乙二醇中的任意一种；接着将精子保存液注入冻存管中，再浸入液氮长期保存；取用时将装有精子保存液的冻存管从液氮中取出，然后立即置于温度为37℃的水浴锅中解冻，再将得到的卷口鱼精子用于人工授精。本发明方法能够长期保存卷口鱼的精子，且解冻复苏后精子成活率。

技术领域

本发明属于生物学低温冷冻保存技术领域，具体涉及一种卷口鱼精子冷冻保存方法。

背景技术

卷口鱼(Ptychidio jordani) 俗称嘉鱼、老鼠鱼，隶属于鲤形目(Cypriniformes)、鲤科 (Cyprinidae)、野鲮亚科(Labeoninae)、卷口鱼属(Ptychidio)。主要分布于我国的珠江水系，为淡水性的土著鱼类。卷口鱼肉质细嫩．味道鲜美，与斑鳠、鲈鱼、鳜鱼并称为珠江四大名贵河鲜，具有极高的经济价值。

近年来，随着过度捕捞以及江河污染的日益加剧，卷口鱼自然资源量急剧下降，加之人们对卷口鱼这一新养殖品种需求的不断扩大，对卷口鱼种苗的品质要求也逐年提高，卷口鱼的精子冷冻技术急需建立起来，因为鱼类精子冷冻是种质资源保存的途径之一，有利于不同生殖期或地理隔离品系的鱼类杂交、选育及遗传多样性的保护。但是目前少有能够长期冷冻保存卷口鱼精子以及复苏的方法，因此，建立卷口鱼精子的冷冻保存技术，对其优良种质资源的保存和人工繁殖技术的提高都具有重要意义。

发明内容

针对上述不足，本发明公开了一种卷口鱼精子冷冻保存方法，能够长期保存卷口鱼的精子，且解冻复苏后精子成活率高。

本发明是采用如下技术方案实现的：

一种卷口鱼精子冷冻保存方法，其包括如下步骤：

（1）精液采集：在卷口鱼繁育季节，选择性腺成熟的健壮雄性亲鱼，麻醉后用干毛巾擦干鱼体生殖孔周围水分和黏液，再沿着中线轻轻挤压腹部至生殖孔流出乳白色精液，用注射器吸取精液，防止尿液、血液和水混入，将采集的精液注入冻存管中；

（2）精液稀释：先将步骤（1）中采集到的精液与稀释液按照体积比为1:3或者1:5或者1:7的比例混合稀释得到溶液A，然后将溶液A与抗冻液按照体积比为1:1的比例混合后得到卷口鱼的精子保存液；所述稀释液为D-17稀释液，Hank’s液和鱼用任氏液中的任意一种；所述抗冻液是由以下体积分数的组分组成：10%或20%或30%抗冻剂，余量为稀释液；所述抗冻剂为二甲基亚砜、甲醇和乙二醇中的任意一种；

（3）精子冷冻保存：将步骤（2）得到的精子保存液注入冻存管中，再将冻存管置于在4℃下平衡30min，接着将冻存管置于液氮表面上方6cm处停留5min，然后将冻存管浸入液氮长期保存；或者将冻存管置于在4℃下平衡30min，接着将冻存管置于液氮表面上方8cm处停留5min，然后将冻存管浸入液氮长期保存；或者将冻存管置于在4℃下平衡30min，接着将冻存管置于液氮表面上方10cm处停留5min，然后将冻存管浸入液氮长期保存；

（4）精子解冻：将装有精子保存液的冻存管从液氮中取出，然后立即置于温度为37℃的水浴锅中解冻，再将解冻后的精子保存液置于4℃下保存备用。