[发明专利]一种高产戊二胺的大肠杆菌工程菌与方法

权利要求书

1.一种高产戊二胺的大肠杆菌工程菌TJU-cadA-1，其特征是所述大肠杆菌TJU-cadA-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏编号为CGMCC No.17454，大肠杆菌TJU-cadA-1高产戊二胺的大肠杆菌工程菌的制备方法，包含如下步骤：

1)以序列Seq id no.1和Seq id no.2为引物，以pET-22b空载质粒作为模板，通过PCR扩增获得pET-22b载体DNA序列，序列为Seq id no.3；

2)以序列Seq id no.4和Seq id no.5为引物，以大肠杆菌基因组为模板，通过菌落PCR扩增获得Pcad启动子序列，序列为Seq id no.6；

3)以序列Seq id no.7和Seq id no.8为引物，以大肠杆菌基因组为模板，通过菌落PCR扩增获得L-赖氨酸脱羧酶DNA序列，序列为Seq id no.9；

4)通过pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Ki技术手段将序列Seq idno.3,Seq id no.6和Seq id no.9连接成环形成重组质粒pET-22b-cadA，序列为Seq idno.10；通过CaCl₂转化法将重组质粒pET-22b-cadA转入大肠杆菌BL21(DE3)获得大肠杆菌工程菌TJU-cadA-1。

2.如权利要求1所述的大肠杆菌TJU-cadA-1高产戊二胺的方法，其特征是包含以下步骤：

1)大肠杆菌工程菌TJU-cadA-1发酵：将大肠杆菌工程菌TJU-cadA-1接种至每升含有1～50g酵母粉、1～50g蛋白胨、1～30g NaCl、1～1000mg氨苄的液体培养基中，在16～45℃，50～350rpm条件下，外源表达L-赖氨酸脱羧酶，培养1～24h后，离心收集富含L-赖氨酸脱羧酶的全细胞；

2)对发酵所得的大肠杆菌工程菌TJU-cadA-1全细胞进行透性处理，离心后获得透性细胞；

3)以L-赖氨酸盐酸盐为底物，采用步骤2)所述的透性细胞催化制备戊二胺。

3.如权利要求2所述的方法，其特征是所述步骤2)的透性处理是采用有机溶剂与水体积比为15％～50％的有机溶液，透性处理富含L-赖氨酸脱羧酶的全细胞，处理条件为0～40℃，50～300rpm，处理时间为1min～2h，透性处理结束后，离心收集富含L-赖氨酸脱羧酶的透性细胞。

4.如权利要求3述的方法，其特征是所述的有机溶剂包括甲醇、乙醇、甲苯或氯仿。

5.如权利要求4所述的方法，其特征是所述步骤3)是在反应釜中加入浓度为100～500g/L的底物L-赖氨酸盐酸盐、浓度为0.1mmol～100mmol的pH 5.6的Na₂HPO₄柠檬酸缓冲液、浓度为1～20g/L的透性细胞和浓度为0.0001～0.1mM的磷酸吡哆醛，在温度为30～45℃，转速为50～400rpm条件下催化制备戊二胺，催化时间为6～24h，戊二胺产率达到90％～100％。