[发明专利]一种高产戊二胺的大肠杆菌工程菌与方法

说明书

本发明涉及一种高产戊二胺的大肠杆菌工程菌与方法，该工程菌是保藏编号为CGMCC NO.17454的大肠杆菌；该方法为：(1)构建外源表达L‑赖氨酸脱羧酶的大肠杆菌工程菌TJU‑cadA‑1，L‑赖氨酸脱羧酶的酶活是空载菌株的100倍左右；(2)将富含L‑赖氨酸脱羧酶全细胞透性处理，透性细胞的L‑赖氨酸脱羧酶的酶活是全细胞的3～4.5倍；(3)利用透性细胞催化L‑赖氨酸盐酸盐生产戊二胺，戊二胺产率在90％～100％，浓度可达220g/L以上。本发明利用L‑赖氨酸盐酸盐高效生产戊二胺，与现有工艺相比，无需诸如昂贵的IPTG诱导剂，传质效率高，产率高，生产成本低，更具经济可行性和实用性。

技术领域

本发明属于生物催化技术领域，具体地，涉及一种高产戊二胺的大肠杆菌工程菌与方法。

背景技术

1,5-戊二胺，又名1,5-二氨基戊烷、五亚甲基二胺、尸胺和尸毒素，是具有多种生物活性的天然多胺，其可通过赖氨酸脱羧酶(E.C.4.1.1.18)催化L-赖氨酸直接脱羧形成，并且广泛分布在原核生物和真核生物中。 1，5-戊二胺在农业，医药和工业中具有广泛应用，特别是作为生物基聚酰胺的重要单体。戊二胺与不可再生化石燃料六亚甲基二胺相似的结构，可替代其合成常规聚酰胺，尤其是与可再生资源的二羧酸聚合生成生物基聚酰胺。因此，戊二胺是一种重要的工业化学品。

目前，戊二胺的生产方法主要包括微生物发酵法或全细胞生物转化法，菌种来源都是通过菌种改造来提高赖氨酸脱羧酶的表达量，往往都需采用昂贵诱导剂来诱导表达，从而大大提高了生产成本。关于微生物发酵法，其菌株通常由具有生产赖氨酸能力的谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌改造而来，存在的主要问题是发酵周期长，转化率低等；此外，发酵体系复杂，杂质多，戊二胺分离纯化困难，进而增加了生产成本。关于全细胞生物转化法，与微生物发酵法区别是先通过发酵富集菌株，再分离获得全细胞菌株，用于生物催化底物L-赖氨酸转化生成戊二胺，优点在于体系杂质少，易于纯化。但是，该方法存在的问题是传质效率低：细胞壁和细胞膜的天然屏障功能限制了底物L-赖氨酸向细胞胞内转运，以及细胞中积累的戊二胺产物的释放，从而降低了转化效率，限制了工业规模化生产。针对于现有方法的诸多问题，本发明开发了一种高产戊二胺的大肠杆菌工程菌和方法，包括外源表达L-赖氨酸脱羧酶的大肠杆菌工程菌制备方法，也包括大肠杆菌工程菌发酵制备和富含L-赖氨酸脱羧酶的全细胞透性处理，还包括高产率的戊二胺催化制备。

发明内容

本发明的目的在于开发一种能够利用L-赖氨酸盐酸盐高效生产戊二胺的方法以及用于该方法的外源表达赖氨酸脱羧酶的大肠杆菌工程菌。该方法无需诸如昂贵的ITPG诱导剂，传质效率高，转化率高，生产成本低。

为了实现了上述目的，本发明的技术方案如下：

一种高产戊二胺的大肠杆菌工程菌，所述大肠杆菌TJU-cadA-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏编号为CGMCC No.17454。保藏日期为2019年3月28日。

本发明的高产戊二胺的大肠杆菌工程菌的制备方法，包含如下步骤：

1)以序列Seq.1和Seq.2为引物，以pET-22b空载质粒作为模板，通过PCR扩增获得pET-22b载体DNA 序列，序列为Seq.3；

2)以序列Seq.4和Seq.5为引物，以大肠杆菌基因组为模板，通过菌落PCR扩增获得Pcad启动子序列，序列为Seq.6；

3)以序列Seq.7和Seq.8为引物，以大肠杆菌基因组为模板，通过菌落PCR扩增获得L-赖氨酸脱羧酶 DNA序列，序列为Seq.9；