[发明专利]一种富含VEGF和FGF的干细胞上清液的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种富含VEGF和FGF的干细胞上清液的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)间充质干细胞的制备；

2)将含有VEGF、FGF的质粒转染至步骤1)获得的间充质干细胞，得到过表达干细胞；

3)利用有限稀释法进行亚克隆，构建稳定表达VEGF和FGF的生产用干细胞；

4)进行生产用干细胞的扩增传代，并收集培养上清液，无菌分装为1ml/支，保存，即得成品。

2.根据权利要求1所述的一种富含VEGF和FGF的干细胞上清液的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)间充质干细胞的制备：

2)将含有VEGF、FGF的质粒转染至步骤1)获得的间充质干细胞，得到过表达干细胞；

A.构建非病毒VEGF和FGF质粒；

B.通过脂质体Lipofectamine2000分别包裹已构建好的非病毒VEGF和FGF质粒，转染至步骤1)获得的间充质干细胞中；

C.更换含800μg/mlG418的opti-MEM换液，继续培养；

D.培养48h，采用荧光定量PCR检测间充质干细胞转染情况，并得到转染后的过表达干细胞；

3)利用有限稀释法进行亚克隆，构建稳定表达VEGF和FGF的生产用干细胞；

a)取步骤2)获得的过表达干细胞，0.25％胰蛋白酶进行常规消化，收集细胞悬液；

b)用血球计数板进行计数，并采用有限稀释法将细胞稀释为10⁵个/ml，每孔接种100μl于96孔细胞培养板中，用含1600μg/mlG418选择培养基100μl/孔，进行选择培养；

c)培养7天，再用0.25％胰蛋白酶进行消化，并扩增至24孔板；

d)进行扩增传代，并逐步减少G418用量至10μg/ml，继续培养，直至扩增量达到所需数量，得到生产用干细胞；

e)常规收集，洗涤，加入干细胞冻存液，分装并作好标记，并采用程序降温法冻存生产用干细胞于-196℃液氮中；

4)进行生产用干细胞的扩增传代，并收集培养上清液，无菌分装为1ml/支，保存，即得成品。

3.根据权利要求1所述的一种富含VEGF和FGF的干细胞上清液的制备方法，其特征在于：所述步骤4)中，具体操作步骤为：

a)将步骤3)获得的生产用干细胞扩增传代二十代，直至细胞数量≥10¹⁰；

b)换成新鲜的无血清干细胞培养基，继续培养生产用干细胞3天；

c)收集生产用干细胞培养上清液，混匀；

d)采用ELISA检测试剂盒测定上清液中VEGF和FGF的表达情况；

e)将收集到的上清液进行透析浓缩至蛋白总浓度为20μg/ml，无菌分装为1ml/支，于-20℃保存，即得成品。

4.根据权利要求1所述的一种富含VEGF和FGF的干细胞上清液的制备方法，其特征在于：所述上清液的细胞浓度≥1×10⁷个/ml。

5.根据权利要求1所述的一种富含VEGF和FGF的干细胞上清液的制备方法，其特征在于：所述上清液中含过表达的VEGF和FGF，且上清液中还含有人表皮细胞生长因子、人角质细胞生长因子、人血小板样衍生生长因子、纤维连接蛋白和免疫因子。

6.根据权利要求1所述的一种富含VEGF和FGF的干细胞上清液的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中的干细胞为脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞中的任意一种。