[发明专利]一种富含VEGF和FGF的干细胞上清液的制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种富含VEGF和FGF的干细胞上清液的制备方法及其应用，本技术方案首先制备获得脐带干细胞，经分子克隆技术“过表达”人血管内皮细胞生长因子(VEGF)和人成纤维细胞生长因子(FGF)，再进行扩增传代，收集细胞培养上清，得到成品干细胞上清液；该上清液可应用于肢端缺血的糖尿病足坏疽创面的修复治疗，本发明工艺设计合理，操作简单，可行性高，得到的上清液中含有过表达的VEGF和FGF，还含有人表皮细胞生长因子、人角质细胞生长因子、人血小板样衍生生长因子、纤维连接蛋白和免疫因子等因子，可应用于糖尿病足肢端缺血症的修复治疗，为干细胞应用于医学转化事业提供一条新的路径，具有较高的实用性。

技术领域

本发明涉及生物学技术领域，具体是一种富含VEGF和FGF的干细胞上清液的制备方法及其应用。

背景技术

根据国际糖尿病联盟统计，2018年我国糖尿病患者数量高达1.14亿，全球成人患者数量4.15亿，且预计至2040年全球糖尿病患者数量将会升至6.2亿。糖尿病足是糖尿病中治疗难度高的慢性并发症之一，病情严重者需要进行截肢。目前糖尿病足的常用临床治疗方法包括降低血糖、创口反复清洗、防止炎症恶化、改善下肢血供、持续负压吸引、高压氧治疗等，而对于肢端缺血严重的糖尿病足患者，一般需进行下肢动脉腔内介入或下肢动脉旁路移植手术，但对于微血管并发症和大血管并发症均严重的糖尿病足患者，手术改善血管循环的疗效不甚理想，截肢的概率依然很大。因此，寻找一种安全、有效的治疗糖尿病足的方法具有非常大的意义。

针对上述问题，我们需要设计一种富含VEGF和FGF的干细胞上清液的制备方法及其应用，用于治疗肢端缺血的糖尿病足坏疽创面的修复，这是我们亟待解决的问题之一。

发明内容

本发明的目的在于提供一种富含VEGF和FGF的干细胞上清液的制备方法及其应用，以解决现有技术中的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种富含VEGF和FGF的干细胞上清液的制备方法，包括以下步骤：

1)间充质干细胞的制备；

2)将含有VEGF、FGF的质粒转染至步骤1)获得的间充质干细胞，得到过表达干细胞；

3)利用有限稀释法进行亚克隆，构建稳定表达VEGF和FGF的生产用干细胞；

4)进行生产用干细胞的扩增传代，并收集培养上清液，无菌分装为1ml/支，保存，即得成品。

较优化地，包括以下步骤：

1)间充质干细胞的制备：步骤1)中进行间充质干细胞的制备，间充质干细胞能够分泌多种细胞因子，如血管内皮细胞生长因子(VEGF)、角质细胞生长因子(KGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板样衍生生长因子(PDGF)、纤维连接蛋白(FN)，间充质干细胞可以迁移到伤口组织、分泌血管内皮生长因子等促进新生血管形成、刺激角质形成细胞参与表皮再形成，进而促进糖尿病足溃疡的愈合、改善临床症状；

2)将含有VEGF、FGF的质粒转染至步骤1)获得的间充质干细胞，得到过表达干细胞；步骤2)中进行过表达干细胞的制备，通过将含有VEGF、FGF的质粒转染至间充质干细胞中，使其过表达；

A.构建非病毒VEGF和FGF质粒；

B.通过脂质体Lipofectamine2000分别包裹已构建好的非病毒VEGF和FGF质粒，转染至步骤1)获得的间充质干细胞中；

C.更换含800μg/mlG418的opti-MEM换液，继续培养；