[发明专利]一种蛋白质变体的定性定量方法在审
申请号: | 201911232113.3 | 申请日: | 2019-12-05 |
公开(公告)号: | CN112924562A | 公开(公告)日: | 2021-06-08 |
发明(设计)人: | 张丽华;王芷婷;刘健慧;单亦初;杨开广;梁振;张玉奎 | 申请(专利权)人: | 中国科学院大连化学物理研究所 |
主分类号: | G01N30/02 | 分类号: | G01N30/02;G01N30/72 |
代理公司: | 沈阳科苑专利商标代理有限公司 21002 | 代理人: | 郑伟健 |
地址: | 116023 辽宁省*** | 国省代码: | 辽宁;21 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 蛋白质 变体 定性 定量 方法 | ||
本发明涉及一种蛋白质变体的定性定量方法。该方法首先利用离子液体对生物样品进行预处理以实现蛋白质的高效提取,并通过使用多种酶切位点的蛋白酶对提取到的蛋白质进行酶切以提高蛋白质定性定量的序列覆盖度。进一步利用液质联用系统对酶切后的肽段进行深度覆盖的数据采集,利用蛋白质组定量方法进行定量分析,提取不同蛋白质变体的特征性肽段,进而实现蛋白质变体的定性定量分析。本发明能够高灵敏度、高序列覆盖率的实现蛋白质组样品的深度覆盖分析,进而区分不同蛋白质变体并获取定量信息,方法对于分析样品、质谱仪器均具有普适性。
技术领域
本发明涉及一种蛋白质变体的定性定量方法,通过结合离子液体提取蛋白与多酶酶切策略,实现高灵敏度、高序列覆盖率的蛋白质组样品的深度覆盖分析,进而区分不同蛋白质变体并获取定量信息,可应用于细胞、组织、器官、石蜡切块、体液、微生物等各类生物样品。
背景技术
在过去的十年里,随着人类基因组测序的完成,影响了各大生物医学研究领域。然而,蛋白质作为生命活动的直接执行者,对其研究同样不容小觑。根据中心法则可以看出,基因调控了蛋白质的表达,但由于单核苷酸多态性(SNPs)、mRNA选择性剪接或翻译后修饰(PTMs)等多种因素的影响,同一基因表达的蛋白质亦可具有不同的形态,即蛋白质变体。蛋白质变体在临床医学研究中具有重要意义,在肿瘤发生、疾病诊断和后续治疗中起着关键作用,对于研究许多复杂疾病的分子机制至关重要。
传统蛋白质变体研究策略有表达序列标签(EST)测序(Science,1991, 262,1651.)、微阵列分析(Genome Biol,2004,5,231.)、mRNA下一代测序(Genome Biol,2004,5,231.)等。然而,这些传统方法有一些局限性:首先,它们都在转录水平上识别变体,不能直接在蛋白质水平上定量;其次,这些方法不能提供肽段翻译后修饰的信息,丢失大量蛋白信息;最后,传统方法的重复性低,不能满足稳定可靠的定量要求。随着液相色谱-质谱联用技术的出现,将蛋白质和肽段的分离与分析结合起来,通过定量蛋白质中特征氨基酸序列的差异实现蛋白质层面的蛋白质变体分析。但由于蛋白质变体氨基酸序列的高度相似,故需要一套完善的蛋白质组学分析方法来实现对蛋白质的深度覆盖定量,从而实现更多特征肽段的解析,更精准、更可靠的定量到不同的蛋白质变体。
目前提升蛋白质组学定量覆盖度主要集中于溶液体系、酶、色谱、质谱等几个方面研究。进行蛋白质组学分析第一步就是将蛋白质尽可能多的提取出来,故要根据蛋白质的亲疏水性选择合适的溶液体系进行提取。常用变性剂有十二烷基磺酸钠(SDS)、尿素;洗涤剂有脱氧胆酸钠(DOC)、月桂酰肌氨酸钠(SLS)(Proteomics,2019,19,1900136.);有机溶剂如甲醇,对提取蛋白也很有效,但会降低胰蛋白酶活性。离子液体因其低蒸发压力、高热稳定性和结构可调性的理想特性被应用于蛋白质组分析,与尿素、十二烷基硫酸钠和甲醇相比,具有良好的增溶能力和胰蛋白酶活性相容性,已应用于膜蛋白组学分析并极大的提高了定量蛋白数及氨基酸覆盖率(Anal Chem,2017,89,5179.)。
胰蛋白酶因其能产生具有可预测裂解的肽段,是大多数鸟枪蛋白质组学研究中首选的蛋白酶,但实验证明使用其他蛋白酶作为胰蛋白酶替代酶是增加蛋白质组覆盖率的一种有效手段(Nature Protocols,2016,11, 993),使用Glu-C、Lys-C和糜蛋白酶对Hela细胞进行酶切,相比胰蛋白酶切获得其他223000个独特的肽段,使覆盖蛋白编码基因的总数增加了300 个(Cell Systems,2017,4,587.)。这说明使用多酶酶切策略能完善对蛋白质组的覆盖,让人们思考用更多种类的酶对人类不同细胞系进行定量。
发明内容
本发明发展了利用深度覆盖发展了一种蛋白质变体的定性定量方法,通过使用离子液体对蛋白质进行高效提取,并结合蛋白多酶酶切以提升蛋白序列覆盖度,通过筛选不同蛋白质变体的特征性肽段的定量信息实现蛋白质变体的定量分析。
为了实现上述目的,本发明采用的技术方案为:
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