[发明专利]胰蛋白酶及其酶原的纯度检测方法

说明书

本发明公开了一种胰蛋白酶及其酶原的纯度检测方法。该纯度检测方法包括以下步骤：将供试品溶液经体积排阻色谱法联合紫外检测法进行检测，即可；体积排阻色谱法中的洗脱液包括流动相A和流动相B；流动相A为含有卤素离子的三氟乙酸水溶液，流动相A的pH值为1.7～2.1；流动相A中，卤素离子的浓度为3～8mM，不包括8mM；流动相B为腈类溶剂；流动相A与流动相B的体积比为35:65～65:35。该纯度检测方法具有分离度好、简单快速、专属性强、准确度高、重复性好和在相对分子质量为3.5kD～48kD范围内线性良好等特点；在含胰蛋白酶及其酶原的原料药合成工艺和制剂工艺中，可用于过程质量控制和终产品质量评价。

技术领域

本发明涉及药物分析检测领域，具体涉及一种胰蛋白酶及其酶原的纯度检测方法。

背景技术

胰蛋白酶及其酶原是胰脏中较为重要的生物活性物质，在胰脏中它们均以酶原的形式存在，其相对分子量在23.8kDa。目前检测胰蛋白酶纯度的方法参照美国药典USP38中收录的反相色谱方法，参照该法进行胰蛋白酶纯度测试时，发现以动物胰脏为原料制备得到的胰蛋白酶中常含有多种不同分子量的杂质，其中部分杂质在反相色谱中的保留时间与主成份相似，无法与主成份进行有效分离。

目前，采用体积排阻色谱法对胰蛋白酶及其酶原进行纯度检测的方法尚未见报道。因此，开发一种分离度好，快速，准确，对胰蛋白酶及其酶原进行纯度检测的有效方法，对药物质量控制和终产品质量的评价具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术中采用反相色谱法对胰蛋白酶进行纯度检测的方法无法有效分离胰蛋白酶及其酶原的主成分峰与周围杂质峰，导致检测结果偏高的缺陷，而提供一种胰蛋白酶及其酶原的纯度检测方法，该纯度检测方法具有分离度好、简单快速、专属性强、准确度高、重复性好、在相对分子质量为3.5kD～48kD范围内线性良好等特点；在含胰蛋白酶及其酶原的原料药合成工艺和制剂工艺中，可用于过程质量控制和终产品质量评价。

目前，采用体积排阻色谱法对胰蛋白酶及其酶原进行纯度检测的方法尚未见报道。在2003年国家食品药品监督管理局颁布的《胸腺肽质量标准》、中国药典2015版垂体后叶注射液以及王吉等人撰写的《体积排阻色谱法测定胸腺肽分子量标准曲线变化的优化》中均报道了选用分子量低于14kDa的核糖核酸酶标准品、人胰岛素标准品、胸腺肽α-1标准品和生长激素释放抑制因子标准品制作标准曲线的方法。制作标准曲线时，均使用不同比例的三氟乙酸-乙腈-水作为流动相。本发明人发现采用上述方法，选用鸡血清白蛋白标准品(44.287kDa)、胰蛋白酶标准品、核糖核酸酶A标准品、人胰岛素标准品、胸腺肽α-1标准品和生长激素释放抑制因子标准品制作标准曲线时，都无法将鸡血清白蛋白标准品、核糖核酸酶A标准品和胰蛋白酶标准品有效分离。本发明人通过创造性的实验来改善洗脱液的成分和配比，提供了一种分离度好、专属性强且标准曲线线性良好的检测方法。同时，发现卤素离子的浓度影响分离效果，当卤素离子的浓度大于8mM时，会导致胸腺肽α-1标准品与生长激素释放抑制因子标准品的峰完全重合，当卤素离子的浓度小于3mM时，会导致胰蛋白酶标准品、核糖核酸酶A标准品和生长激素释放抑制因子标准品的分离度小于1.5。当流动相A的pH值小于1.7时，易破坏色谱柱内部填料的结构，当流动相A的pH值大于2.1时，会导致各标准峰之间分离度变小，甚至出现峰重合的现象。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的。

本发明提供了一种胰蛋白酶及其酶原的纯度检测方法，其包括以下步骤：将供试品溶液经体积排阻色谱法联合紫外检测法进行检测，即可；

所述的体积排阻色谱法中的洗脱液包括流动相A和流动相B；所述的流动相A为含有卤素离子的三氟乙酸水溶液，所述流动相A的pH值为1.7～2.1；所述的流动相A中，所述的卤素离子的浓度为3～8mM，不包括8mM；所述的流动相B为腈类溶剂；所述的流动相A与所述的流动相B的体积比为35:65～65:35。