[发明专利]一种树木根腐病的评价方法

说明书

本发明提供一种树木根腐病的评价方法，包括如下步骤：(1)采集根际土壤样品；(2)对步骤(1)所得的土壤样品进行DNA抽提和PCR扩增；(3)Illumina Miseq测序；(4)数据处理，得到真菌群分析结果；(5)建立树木健康等级评价表，结合真菌群分析结果，得出评价结果，判断标准如下，正常：有害菌群＜20％；一般：20％≤有害菌群≤40％；衰弱：40％＜有害菌群＜50％；高危：有害菌群≥50％。本发明能快速、安全及精准地完成对古树根腐病的监测，为树木根腐病的防治、古树名木的保育提供技术支撑。

技术领域

本发明涉及植物病况的监测与评价技术领域，特别是涉及一种树木根腐病的评价方法。

背景技术

木腐病即由某些木材腐朽菌引起的活立木树体木质的腐烂。病原菌一般先侵染树体伤口，进而侵染和杀死功能木质部及形成层组织，引起根腐、溃疡乃致树体死亡。从分类学地位看，木材腐朽菌主要是担子菌门(Basidiomycota)和子囊菌门(Ascomycota)的真菌，其中最主要的病原菌种为有害木层孔菌(Phellinus noxius)，该菌种属于担子菌门，层菌纲，非褶菌目，锈革孔菌科，木层孔菌属，生长最适温度30℃，8℃以下不生长。在PDA培养基上生长迅速，菌落初期白色至草黄色，后变成湖泊褐色至暗褐色，产生特征性不规则暗褐色纹线或凹陷，形成节孢子和毛状菌丝。在自然条件下极少形成担子果。该病原菌寄主范围十分广泛，可危害超过59科200种植物，因此，加强进出境检验检疫措施，防止病害进一步扩散蔓延的意义重大。根据木材腐朽菌感染的植物部位，木腐病可分为根腐病、叶腐病及茎腐病等。古树的根部往往被较厚的土层覆盖，工作人员不能直接观察到其根腐情况，而根系是植物六大营养器官之一，是植物赖以生存的生命线，主要负责吸收、运输养分及固定植物体。因此，根腐病作为其中一种病发于植物根部的木腐病，是最隐晦、最严重的植物木腐病，制定一种根腐病的监测与评价方法显得十分必要。

此外，古树名木具有是重要的森林资源，生态效益好。古树多为典型乡土树种，对当地气候与土壤条件等环境的适应性强，也是本地绿化种植的首选树种之一。古树名木还有历史文化、生态及观赏等重要价值。

现有技术中，真菌多样性的研究主要利用分离培养及形态学检测的方法，该技术在实验室被广泛使用。传统的真菌分类与鉴定都是基于病原菌的形态学特征，如病原菌危害植物时造成的显著症状表现、菌丝形态、孢子形态等。有些真菌(如木材腐朽菌)一般都能产生大型子实体，运用传统方法进行鉴定时主要根据其子实体的特征进行，包括观察其担子果一年或多年生，菌盖的形状、大小及颜色，菌管的颜色、大小，孔口形状、颜色等；对于一个属或一个种的真菌，有时子实体特征差异极小时，还要结合一些显微特点进行鉴定，比如菌丝结构、生殖菌丝的特点、担孢子等。但是，外观特征是细胞内部基因与外界环境综合作用的结果，不同的外界环境容易导致真菌外观形态的差异，仅仅依靠外观形态特征进行鉴定，有时会造成同物异名或同名异物的现象，引起混乱。尽管各种新的培养技术不断出现，但传统的分离培养及形态学检测法费时费力，敏感度和特异性也较低，不能反映全部的真菌群落信息。国外微生物学家曾根据微生物原位的、不依赖于培养的微生物系统发育学研究结果认为：通过实验室人工培养方法已经被分离和描述的自然界中的微生物物种数量仅占估计数量的1％～5％，其余大多数微生物种群还仍然未被分离和认识，因此，人们不能利用传统的微生物培养技术获得真菌多样性的全部信息，极大限制了对微生物研究的广泛性。

近年来，随着分子生物学的发展，真菌分类也从传统的依据形态学特征转变为主要依靠现代生物技术、即相关分子生物学方法进行菌物的鉴定和分类，双管齐下。IlluminaMiseq高通量测序技术能够对环境微生物进行高覆盖率、高深度测序，深入挖掘样本中的信息。

根际土壤真菌是土壤－植物生态系统的重要组成部分，真菌群落的组成及丰度与植物生长发育、土传病害的发生发展密切相关。根腐病是一种通过土传的病害，因而植物根际土壤真菌群落多样性及生态功能已成为根腐病菌鉴定研究的重点。危害植物根部的木材腐朽菌主要、最可能分布在宿主植物成株周围土壤，且致病真菌相对丰度随距植物根部地理距离的增加而递减。古树名木作为根腐病高危植物，其根际土壤真菌多样性的研究目前尚未见报道。