[发明专利]一种LAMP氢离子驱动i-motif变换比率型电化学传感器及构建方法

权利要求书

1.一种LAMP氢离子驱动i-motif变换比率型电化学传感器的构建方法，其特征在于，先将用不同电活性物质标记的两条DNA单链进行反应，然后将所得产物滴加至电极表面，最后在电极表面滴加LAMP反应溶液，即可完成所述传感器的构建；其中，LAMP反应溶液是通过以下方法制备得到的：利用hDNA与模板HT和前驱体HP进行扩增后，制备具有内引物结合位点的特殊双哑铃DNA结构，然后以该结构为起始模板，经LAMP扩增获得含大量副产物H⁺的LAMP反应溶液；

所述的两条DNA单链为S1和S2，它们分别用二茂铁Fc和亚甲蓝MB标记，得Fc-S1和MB-S2，即为电化学信号探针,所述Fc-S1分别在S1的5’端和3’用巯基(-SH)和Fc修饰，自由状态的构象为发夹结构，Fc-S1通过Au-S键结合到电极表面；所述MB-S2在S2的3’端修饰MB，其18个碱基富含14个C碱基，能形成具有pH响应的i-motif结构，且互补于Fc-S1的茎和环的18个碱基，能打开Fc-S1并与之杂交；

所述HT为根据hDNA的碱基序列设计的含一茎-环发夹结构的DNA模板，其3’端用磷酸基团(PO4^3-)修饰，靠近3’端为hDNA的互补序列；所述 HP为含一茎-环发夹结构的DNA前驱体，其3’端方向的21个碱基能与HT中靠近hDNA 互补序列的21个碱基杂交。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，Fc-S1和MB-S2的反应温度为室温，反应时间为2小时，所得产物滴加至电极表面并孵育16 小时。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述内引物为BIP和FIP。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，LAMP扩增的反应条件为：在PCR仪中于65℃闭管反应40分钟。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：

（1）制备具有内引物BIP和FIP结合位点并能延伸的特殊双哑铃DNA结构；

（2）加入内引物BIP和FIP，该双哑铃DNA结构为起始模板，进行延伸和扩增，得到含大量副产物H⁺的LAMP反应溶液；

（3）将两电化学信号探针Fc-S1和MB-S2在室温反应2小时后，滴加到电沉积金的玻碳电极表面；

（4）在上述电极表面滴加LAMP反应溶液。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，特殊双哑铃DNA结构的制备方法如下：目标物hDNA与两条特殊的茎-环发夹DNA模板HT和DNA前驱体HP、DNA聚合酶Bst以及dNTPs，在PCR仪中于50 ℃闭管反应20 分钟，形成具有内引物BIP和FIP结合位点并能延伸的特殊双哑铃DNA结构。

7.利用权利要求1～6中任一项所述方法构建的LAMP氢离子驱动i-motif变换比率型电化学传感器。