[发明专利]一种LAMP氢离子驱动i-motif变换比率型电化学传感器及构建方法

说明书

本发明涉及一种LAMP氢离子驱动i‑motif变换比率型电化学传感器及构建方法，通过常规LAMP技术与电化学检测相结合，利用目标物短链DNA延伸形成的双哑铃状结构中间体进行LAMP扩增，其副产物H⁺诱导i‑motif构象转换实现比率型电化学信号的显著改变和放大输出，避免常规LAMP技术模板DNA及引物设计的复杂性和局限性，保障LAMP高特异性和简便快捷，同时提升检测灵敏度。两种电化学探针的信号比值能有效降低背景信号，确保高特异性和高灵敏度、良好的稳定性和再生性。本发明建立的电化学检测方法简单方便快捷；无需引入其他辅助反应物，提高定量检测的特异性和灵敏度，缩短分析时间，降低检测成本。

技术领域

本发明属于生物传感器技术领域，涉及一种LAMP氢离子驱动i-motif变换比率型电化学传感器及构建方法。

背景技术

近年来，一些遗传学疾病、恶性肿瘤等已严重威胁着人类生命健康，给社会造成了严重的经济负担。其中，艾滋病由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起。据世界卫生组织统计，2016年底全球约有3700万人感染HIV，而我国约占70万人。大量研究证实，HIV感染人群并发感染其他病毒如人乳头瘤病毒的风险明显增加。因此，灵敏、快速、便捷、准确检测HIV特异性标志物(如DNA、RNA、蛋白质等)，对于其早期诊断、治疗、病情追踪等具有极其重要的现实意义和社会价值。

环介导等温扩增(LAMP)是在闭管内于65℃45min～1h即可完成的一种强有力的核酸放大技术。其扩增机理是以长达150、甚至200个碱基以上的基因序列为目标物模板，在DNA聚合酶作用下，引物链末端的3'-OH对三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)的α-磷原子发起亲核进攻，3'-OH上的H被核苷酸碱基置换而释放H⁺和焦磷酸根离子，引物不断延伸而实现10⁹放大倍率。因此，除长短不一的双链DNA主产物外，生成的大量H⁺(同时焦磷酸水解也产生H⁺)会引起LAMP反应溶液pH的改变(LAMP-H⁺)。

LAMP技术具有高特异性，操作简便，快速高效，无需特殊昂贵仪器，已广泛用于细菌、病毒、生物酶活性、有机小分子、转基因食品的检测，以及临床疾病诊断和胚胎性别鉴定等。但也存在诸多不足，如扩增目标物模板过长、引物设计要求高、对单核苷酸多态性识别能力差、扩增产物难以准确定向控制等。常用的直接检测方法如凝胶电泳、浊度法、比色法和荧光法，以及间接的pH计测定，由于定量灵敏度低、稳定性差、操作不便等，极大限制了LAMP 方法的实际应用能力。而通过改变LAMP反应装置，如与微流控或毛细管进行联用，设备复杂成本高、操作繁琐耗时、技术要求高；而在LAMP反应过程中引入生物连接酶或切割酶，或磁珠形成乳液微反应器，再经离心、磁分离、破乳、洗脱等步骤，不仅过程繁琐耗时，引入新的试剂还可能改变LAMP反应进程，加剧反应体系动力学过程的不确定性和复杂性，使得LAMP反应溶液更加多元，给后续定量检测带来更大的潜在干扰和假阳性信号，一定程度上会降低LAMP技术的特异性和灵敏度。近来，通过逆转录和连接反应，以仅有约20～30个碱基的目标miRNA通过链杂交反应形成双哑铃结构DNA引发LAMP反应，虽然极大简化了DNA模板和引物的设计，拓宽了LAMP的应用范围，但逆转录和连接反应使得LAMP扩增过程和产物组成复杂化。最近，将LAMP-H⁺诱导二聚体i-motif形成后，引入修饰电极表面启动酶支持的DNA行走放大，建立了测定流感病毒DNA电化学生物传感器。这为将LAMP 放大与简便快捷、高灵敏、信号窗口宽的电化学分析相结合，并建立新型DNA电化学生物传感器提供了新思路和新途径。但目前尚无利用LAMP-H⁺转换信号的比率型电化学分析方法的相关报道。

发明内容

鉴于此，本发明的目的在于提供一种LAMP氢离子驱动i-motif变换比率型电化学传感器及构建方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：