[发明专利]一种可检测SNP的新型CPA方法、引物组和试剂盒

说明书

本发明公开了一种可检测SNP的新型CPA方法，包括以下步骤：(1)提取DNA为待检测模板；(2)设计交叉引物组，交叉引物上设计与该DNA突变位点相结合的RNA碱基；(3)建立反应体系，反应体系中包含RnaseHⅡ酶，将待检测模板加入到反应体系中进行扩增，当交叉引物与DNA突变位点相结合时，激活RnaseHⅡ酶发生切割，使扩增反应继续进行，当交叉引物与DNA突变位点不能结合时，扩增反应无法进行；(4)判断反应物中是否具有目标DNA。相应的，本发明还公开了基于上述方法的用于检测鸡白痢沙门菌的引物组和试剂盒。本发明的检测方法具有特异性强和灵敏度高的优点。

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种可检测SNP的新型CPA方法、引物组和试剂盒

背景技术

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)是在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，即DNA序列中单个碱基的差别。在自然界中，SNP广泛存在，对于SNP的检测分析在药物研制、临床检验和基因突变诊断等方面具有重要意义。

目前主流的SNP检测技术包括PCR-高通量测序技术、毛细管电泳技术，流式荧光杂交、变性高效液相色谱检测、等位基因特异寡核苷酸片段分析，PCR-焦磷酸测序技术、ARMS-PCR技术和HRM技术等，这些方法在SNP检测中或流程冗杂、或灵敏度低、或特异性差、或成本高，或易污染，因此亟需发明一种更好地检测SNP的新方法。

交叉引物恒温扩增(CPA)通过对靶基因设计五条特异性引物，在55～65℃恒温下可对靶基因实现指数级扩增，目前可用于疾病诊断和病原体的检测。与环介导等温扩增技术主要由两条内引物介导相比，CPA的循环扩增反应主要在一条交叉引物介导下完成，然而两者目前都只能用于扩增一定的基因片段而无法实现对SNP的检测。

鸡白痢病(PD)是由鸡白痢沙门菌引起的系统性疾病，主要造成幼龄小鸡死亡，母鸡产蛋量下降，该病能垂直传播，往往造成养殖场的重大损失。国务院提出2020年全国所有种鸡场的鸡白痢沙门菌病达到净化标准，但目前部分场净化效果还不太理想。鸡白痢沙门菌的早期快速检测鉴别是该病防控和净化的基础。鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌和肠炎沙门菌在临床症状上往往相似难以分辨。传统的分离鉴定方法流程冗长，如玻片凝集试验容易发生非特异性反应并且缺乏敏感性，因为三者都属于D血清群，在抗原表达式上非常接近，纯粹依据抗原式容易误判，目前临床用于特异性区分鸡白痢沙门菌与其他不同血清型沙门菌的方法非常有限，在目前国内养殖场提倡净化鸡白痢的大环境下，发明一种方便快速、敏感特异的鸡白痢沙门菌检测方法具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提出一种可检测SNP的新型CPA方法，具有特异性强，敏感性高的特点。

本发明的目的在于提出一种基于上述方法检测检测鸡白痢沙门菌的引物组和试剂盒，具有准确快速检测出鸡白痢沙门菌的特点。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一种可检测SNP的新型CPA方法，包括以下步骤：

(1)提取DNA为待检测模板；

(2)设计交叉引物组，交叉引物上设计与该DNA突变位点相结合的RNA碱基；

(3)建立反应体系，反应体系中包含RnaseHⅡ酶，将待检测模板加入到反应体系中进行扩增，当交叉引物与DNA突变位点相结合时，激活RnaseHⅡ酶发生切割，使扩增反应继续进行，当交叉引物与DNA突变位点不能结合时，扩增反应无法进行；

(4)判断反应物中是否具有目标DNA。

进一步的，步骤(4)中，以显色法检测反应物中是否具有目标DNA。

进一步的，交叉引物组包括引物：LoopB、B3、F3、B2和BIP。