[发明专利]一种调控CAR-T特异性活化的启动子及其应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种调控CAR‑T特异性活化的启动子及其应用。所述启动子受缺氧环境调控，由Hif1a调节元件和迷你启动子连接构成，所述Hif1α调节元件的重复数为4个，所述Hif1α调节元件的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。所述启动子能够在缺氧环境强化目的基因表达并在缺氧环境中能够加强CAR‑T细胞的活化，提高CAR‑T细胞针对肿瘤靶细胞的杀伤。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种启动子、一种CAR结构、一种分离的核酸分子、一种表达载体和一种CAR-T细胞以及其在制备肿瘤药物中的应用和一种提高缺氧环境下CAR-T细胞杀伤能力的方法。

背景技术

CAR-T全称是嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，其在血液系统瘤中取得较好的成绩，但CAR-T在实体瘤中的效果不如血液系统瘤，其原因一方面因为CAR-T较难进入实体瘤内部，一方面即便CAR-T细胞进入实体瘤内部也因为肿瘤微环境而不能正常发挥功能，这些都影响CAR-T细胞在实体瘤治疗的疗效；并且由于实体瘤异质程度高，实体瘤靶点往往在正常组织也有所表达，因此还存在脱靶风险等安全问题。虽然目前有构建第四代CAR、有构建双CAR(构建带有双抗原的CAR-T)或带有激活抑制功能的iCAR的结构以期望提高实体瘤CAR-T治疗的有效性和安全性，但这些CAR结构仍存在安全性或较难被激活的问题。因此，构建一种在肿瘤微环境中特异启动活化的CAR结构很有必要。

酸性和缺氧是肿瘤微环境中的两大物理因素，实体瘤中的大部分的细胞都处在缺氧的环境中，而缺氧改变了肿瘤细胞的糖代谢途径，产生大量的乳酸，造成肿瘤微环境中酸性的特征，而这些酸性可以降低肿瘤细胞凋亡，增强细胞的增殖和生长，并且帮助肿瘤细胞的迁移。缺氧在实体瘤微环境研究比较清楚，如果可以设计在缺氧条件下被激活的可调控启动子，就可以达到在肿瘤微环境中特异性激活下游蛋白的表达从而提高CAR-T细胞的有效性和安全性的目的。

虽然关于肿瘤组织缺氧的理论研究较多，但如何应用缺氧环境联合CAR-T治疗还是新的方向，需要全面的研究和尝试。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种启动子，及包含所述启动子的CAR结构、表达载体和CAR-T细胞。所述缺氧可调控的启动子能够在缺氧环境强化目的基因表达，增强目的因子(蛋白、核酸等)的表达，提高抗肿瘤的药物疗效。

本发明从肿瘤自身的缺氧微环境出发，通过构建缺氧激活的调控元件特异性调控蛋白的表达，调控CAR-T特异性活化，通过体外药物构建缺氧环境的成功以及后续的CAR-T杀伤的结果显示在CoCl₂诱导的缺氧条件下的CAR-T比不诱导的CAR-T有更强的杀伤作用，同时说明了所构建的CAR结构和CAR-T具有缺氧微环境被动靶向性特征，在缺氧微环境中有更强活性和杀伤力，而在非缺氧微环境中则体现出了安全性特征。这对CAR-T的临床应用以及肿瘤联合治疗新策略的开发具有重要的指导意义。

为实现上述目的，本发明采用以下方案：

一种启动子，其特征在于，所述启动子由重复数为4的Hif1a调节元件和迷你启动子连接构成，所述Hif1α调节元件核酸序列如SEQ ID NO：1所示。所述启动子为4HRE-CMVmini promoter。

具体的，所述Hif1α调节元件为4个重复的串联，所述串联不仅指的是两个核酸序列直接相连，即一个核酸序列的3’端和另一个核酸序列的5’端直接连接，还包括两个核酸序列可以间接进行连接，即在两个核酸序列中间也可以连接有其他的核酸序列，只要不影响这两个核酸序列功能的表达即可。

进一步，所述启动子受缺氧环境调控，所述迷你启动子选自细胞病毒启动子、HSV胸苷激酶的启动子、猿猴病毒40的启动子、腺病毒晚期启动子和合成启动子中的任一。

优选的，迷你启动子选择miniCMV。