[发明专利]含羟脯氨酸与羟赖氨酸的重组类人胶原蛋白及其生产方法

说明书

本发明公开了含羟脯氨酸与羟赖氨酸的重组类人胶原蛋白及其生产方法。含羟脯氨酸与羟赖氨酸重组类人胶原蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述含羟脯氨酸与羟赖氨酸重组类人胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。该重组类人胶原蛋白利用克鲁维酵母为底盘细胞，分别将四种不同的载体pKLAC1‑hlCOL、pKLC‑P4HA、pKLC‑PDI、pKLC‑LH进行共表达，经过一系列的发酵、纯化方法来获取。重组类人胶原蛋白脯氨酸与赖氨酸的羟化率与天然人源I型胶原相近，分别达到30.7％、43.1％。相比未羟基化的重组类人胶原蛋白，具有更好的促进细胞粘附以及促进伤口愈合的功能。

技术领域

本发明涉及生物重组蛋白技术领域，特别涉及一种含羟脯氨酸与羟赖氨酸的重组类人胶原蛋白及其生产方法。

背景技术

胶原蛋白是脊椎动物的主要结构蛋白，约占生物体总蛋白的30％。人类肌腱、骨、以及皮肤超过一半的细胞外基质蛋白均由胶原蛋白组成。胶原蛋白以其特殊的结构与功能，作为一种重要的生物材料，在药物输送、外科缝合、组织填充、神经修复、皮肤美容等领域有着越来越广泛的应用。

时至今日，胶原蛋白主要来源依旧为动物源胶原，如鱼等海产品以及牛、猪等牲畜加工副产物，通过酸、碱、酶等提取工艺来获取，但动物源胶原存在以下明显不足：1)终产物成分复杂，活性成分结构不明确，在剧烈的提取工艺过程中活性结构容易被破坏；2)非人源蛋白，具有免疫原性，过敏反应风险不容忽视；3)存在疯牛病等朊病毒风险，且宗教信仰问题难解决。

随着生物科技的发展，利用微生物作为底盘细胞来实现胶原蛋白的表达生产，可以很好地解决动物源胶原固有的难题。首先，人源化可以大大提高生物组织相容性，解决了免疫原性问题；其次，重组蛋白结构设计目的性更强，成分更明确，可以大大提高胶原蛋白的生物活性；再次，不使用动物源成分，杜绝了朊病毒来源，且从根本上解决了宗教信仰问题。基于此，近年来关于重组胶原蛋白的研究和应用呈上升趋势。

中国发明专利申请CN201910091891.9公开了一种利用毕赤酵母生产重组人源II型胶原蛋白单链的方法。PCT/US2018/053601公开了一种利用多种微生物表达系统表达重组类人胶原的方法。尽管以上方法取得了一定效益，但在重组胶原蛋白结构设计上依旧不是很清晰，尤其是对脯氨酸与赖氨酸的羟基化功能的缺失，也制约了重组胶原蛋白的进一步应用。

天然胶原蛋白结构复杂，分子量大，同动物源提取的胶原蛋白相比，目前重组胶原蛋白仍难以“以量取胜”，只有设计更为合理有效的结构才能更好地实现“以质取胜”。此外，天然胶原蛋白结构中含有约23％的羟脯氨酸与羟赖氨酸。这些羟基化位点与胶原结构形成、原纤维功能、组织发育、以及多种病理学密切相关。例如，羟赖氨酸的缺乏会造成爱唐综合征(Ehlers-Danlos syndrome type VI)、布鲁克综合征(Bruck syndrome，BS)、以及骨骼发育不良等疾病。随着年龄的增长，人类皮肤组织中赖氨酸羟化酶的含量会呈现大幅度地下降。

Christoph R等人在大肠杆菌中实现了重组胶原蛋白的羟基化(Recombinantexpression of hydroxylated human collagen in Escherichia coli,2013)；中国发明专利申请CN201810707153.8公开了一种通过将源于囊孢菌RH1的脯氨酸羟基化酶与人源胶原基因在大肠杆菌中进行共表达，实现了胶原蛋白的脯氨酸羟基化的方法。此类方法虽在一定程度上解决了重组胶原蛋白的部分羟基化问题，但也存在以下不足：1)重组人源胶原蛋白结构功能设计依旧不明确；2)对于羟基化完全的大肠杆菌来说，大肠杆菌属于非GRAS表达宿主(Generally Recognized as Safe，为美国FDA评价食品添加剂的安全性指标)，此外，下游纯化工艺复杂，去除内毒素难度大。3)对于其他表达宿主来说，羟基化仅限于脯氨酸羟基化，难以做到脯氨酸与赖氨酸的同步羟基化。

发明内容