[发明专利]一种体外培养乳腺癌循环肿瘤细胞的方法

说明书

本发明提供了体外培养乳腺癌循环肿瘤细胞的培养基，所述培养基包括基础培养基、细胞生长因子和添加剂，该培养基可大量扩增高质量高纯度的循环肿瘤细胞。本发明还提供了乳腺癌循环肿瘤细胞的分离富集方法，所述乳腺癌患者的外周血通过CellSearch外周血循环肿瘤细胞检测仪系统分离、富集和计数CTC；或应用CD326(EpCAM)标记的免疫磁珠特异性捕获乳腺癌外周血中的CTC。该方法操作简单、成本低廉、普适性广，能够快速有效地实现乳腺癌循环肿瘤细胞的扩增培养。

技术领域

本发明涉及细胞技术领域，特别涉及一种体外培养乳腺癌循环肿瘤细胞的方法。

背景技术

循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)是指由实体肿瘤上脱落下来进入血液或者淋巴系统的肿瘤细胞。CTCs数量与癌症发展进程和转移密切相关。大量临床研究表明，对CTCs数量进行跟踪监控有助于癌症早期诊断，预后判断和药效评估。

经过大量的临床研究，研究人员在许多恶性肿瘤(乳腺癌、结直肠癌、肺癌、前列腺癌等)中都发现了CTCs的存在。目前，临床上对肿瘤的检测有以下几种常规方法：影像学诊断、内窥镜检查和病理学诊断，与传统检测方法相比， CTC检测有两个明显优势：(1)CTCs检测是非侵入式的，医生或者研究人员只需要从患者体内抽取少量的外周血(几毫升左右)，这一过程是无创/微创的，而且没有任何副作用，同一患者能够反复多次采集，不需要通过对患者采取手术或者穿刺等侵入性方式来获取组织标本。(2)目前临床可及的影像学等检测手段的灵敏度和精准度有一定的限制，而CTCs能更早期地发现肿瘤的动态变化情况，有助于对肿瘤患者进行实时个体化的预后判断、复发风险预警和转移情况监控等。

目前，对CTCs的研究主要集中在早期筛查、辅助肿瘤分期、预后评估、个体化治疗策略制定，疗效及耐药监测、复发和转移预警等方面。现市面上可及的CTC分离及富集相关试剂盒，其主要原理是利用人外周血循环肿瘤细胞差相富集试剂盒，采用密度梯度离心法，从全血样本中分离出外周血单个核细胞 (Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)，再通过偶联了抗人CD45单克隆抗体的免疫磁珠去除肿瘤病人PBMC细胞中的CD45+细胞，从而富集病人外周血标本的CTCs。

然而，一般情况下，循环肿瘤细胞在外周血中存在的频数是10^-6-10^-7，而既往传统用于富集和检测外周血中的肿瘤细胞的方法是磁珠分选后再予免疫细胞化学或免疫荧光染色等确认，这些方法很难检测到频度低达10^-6的肿瘤细胞，流式细胞仪的敏感度最高可以达到10^-3-10^-4，但检测低频细胞易混杂非特异性细胞，造成假阳性，且流式分选压力后细胞活力相对较差。另外，不同的乳腺癌患者中的CTC存在较大的个体差异，同一患者不同时期的检测或不同操作者的检测都可能对CTC的检测结果造成很大的差异。因此，传统富集CTC的方法，得到的纯度不够高，难以准确定量且可重复性差。这些均是富集CTC并进行进一步体外生物学特性研究的“瓶颈”。现有的方法是针对于从外周血中提取出 CTC，而CTC在外周血中含量较低，提取出符合实验要求数量CTC往往需要抽取大量患者的血液，大大降低临床可实践性。因此，迫切需要合适的CTC体外培养增殖方法，以利于体外培养CTC，用于后续的药物筛选等各种相关研究。

发明内容