[发明专利]一种上清和沉淀协同定量的蛋白质热稳定性分析方法

说明书

本发明涉及一种基于上清和沉淀协同定量的蛋白质热稳定性分析新方法用于鉴定与配基分子有相互作用的蛋白质。取等份蛋白质样品，分别加入和不加入配基分子，孵育后在特定温度下进行加热，然后分离加热后得到的上清液和沉淀，最后对加入和不加入配基分子的上清样品和沉淀样品分别进行酶解以及定量蛋白质组学分析来确定与配基分子相互作用的靶蛋白。由于可以在同一个温度点进行加热使得整个实验操作过程变的非常简单，并且得益于综合利用了上清样品和沉淀样品中蛋白质的互补信息，本发明相比于传统的蛋白质热稳定性分析方法具有更高灵敏度和选择性。因此可用于不同亲和力的配基分子和蛋白质的相互作用研究。

技术领域

本发明属于蛋白质组学研究方向蛋白质与配基分子相互作用技术领域，具体涉及一种高灵敏度、高选择性鉴定药物靶蛋白的方法及其应用。

背景技术

药物靶蛋白和脱靶蛋白的高灵敏度鉴定一直是药物研究领域一个重大的挑战。长期以来，传统的基于靶点的方法和基于表型的方法一直被沿用，但是这两种方法都存在着非常明显的缺陷，已经不能满足需求。

近年来，随着质谱技术的高速发展，几种基于质谱的蛋白质组学技术开始被应用到药物靶蛋白的鉴定中。除了具有较高的通量之外，这些技术在不需要对药物分子进行任何修饰的情况下，可以较好的鉴定出药物分子的直接靶蛋白和非直接靶蛋白。其中包括：药物亲和力响应靶点稳定性方法(DARTS)(Target identification using drug affinityresponsivetarget stability(DARTS),Proc.Natl Acad.Sci.USA.106,21984–21989(2009))、限制性酶切方法(LIP)(A Map of Protein-Metabolite Interactions RevealsPrinciples of Chemical Communication，Cell,172,358-372.e23(2018))、蛋白质氧化速率稳定性方法(SPROX)(Thermodynamic analysis of protein-ligand bindinginteractions in complex biological mixtures using the stability of proteinsfrom rates of oxidation.Nat.Protoc.8,148–161(2013))和蛋白质热稳定性分析方法(TPP)(Tracking cancer drugs in living cellsby thermal profiling of theproteome，Science,346,1255784(2014))。前三种方法的主要缺点是需要鉴定并且定量到特定的肽段，由于蛋白质丰度、样品复杂度和质谱鉴定的影响，这是相当困难的。

蛋白质热稳定性分析方法利用蛋白质在不同的温度下具有不同的热稳定性，由于部分热量会用于将药物分子从蛋白质上解离下来，导致与药物分子结合的蛋白质和没有与药物分子结合的蛋白质在相同的温度下具有不同的热稳定性，加热之后沉淀出来的蛋白质的量不同。蛋白质热稳定性分析方法被广泛应用于蛋白质和药物分子、蛋白质和代谢物、蛋白质和核酸、蛋白质和蛋白质等之间的相互作用。但是传统的蛋白质热稳定性分析方法设置较多的温度点进行实验，操作繁琐，利用TMT标记定量，不仅价格昂贵而且耗费大量的质谱使用时间。除此之外，传统的方法也存在着鉴定灵敏度不够高的问题，拟合熔化曲线计算ΔTm的方法没有办法高选择性地将变化的靶蛋白和没有变化的非靶蛋白区分开。为了提高靶蛋白鉴定效率，所有对于鉴定有利的信息都应该被利用，加热之后的沉淀样品中同样包含很多有意义的信息，不应该被遗漏。

为了在解决传统蛋白质热稳定性分析方法操作复杂、价格昂贵等问题的同时提高药物分子靶蛋白鉴定的灵敏度和选择性，我们拟发展一种上清和沉淀协同定量的蛋白质热稳定性分析新方法用于配基分子靶蛋白的高灵敏和高选择性鉴定。

发明内容

本发明的目的在于提供一种流程简单、高灵敏度和高选择性的配基和蛋白质相互作用研究的新方法。