[发明专利]一种无歧视的蛋白质热稳定性分析方法

权利要求书

1.一种无歧视的蛋白质热稳定性分析方法，其特征在于：

该方法利用加热沉淀后配基靶蛋白在配基组和空白组的直接差异，去筛选配基靶蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法的具体步骤为：

(a)确定蛋白质混合物发生沉淀的最适温度区间；

(b)蛋白质混合物分成二组或两组以上，一组以上加入一定终浓度的配基分子(配基分子溶于特定溶剂)作为配基组，另一组加入等体积的空白溶剂作为空白组，同时在室温下进行孵育；

(c)将孵育后的配基组和空白组分别分成2-5份，在最适温度区间加热引起蛋白质变性发生沉淀；配基组和空白组分别按加热温度从低至高排序，加热温度依次间隔2-5℃，且保证最低加热温度份的加热温度为47-49℃，最高加热温度份的加热温度为58-60℃；加热时间1-5min；(d)分离加热后各份的上清液，进行蛋白酶解和定量蛋白质组学分析；

(e)直接分析配基组和空白组的蛋白质定量结果差异，筛选配基分子靶蛋白。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

步骤(a)和步骤(b)所述的蛋白质样品可以是细胞提取液，组织提取液，血液等蛋白质混合物或者纯化的蛋白质等中的一种或二种以上；所述的蛋白质样品必须保持蛋白质完整的天然结构，不能发生变性；应采取一些温和的提取蛋白质的方法，包括：液氮反复冻融法、液氮研磨法和匀浆法等中的一种或二种以上；所用的裂解液也应该能够维持蛋白质的结构，包括磷酸缓冲液(PBS)等。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于；

步骤(a)所述的确定最适温度区间的具体步骤为：

等量量取蛋白质溶液于8-39个不同的EP管中，不同的EP管分别在37-75℃温度范围内不同温度下进行加热，不同的EP管按加热温度从低至高排序，加热温度依次间隔1-5℃，且保证最低加热温度EP管的加热温度为37-38℃，最高加热温度EP管的加热温度为72-75℃；加热时间1-5min；

分离加热后各EP管中的上清液进行蛋白酶酶解和定量蛋白质组学分析，计算不同温度下上清液剩余蛋白质的量；以最低加热温度下EP管上清液剩余蛋白质的量去除其它加热温度下EP管上清液剩余蛋白质的量，根据每个温度下剩余蛋白质的量的分布，选取中位数介于0.1-0.25的加热温度作为最高温度，选取中位数介于0.75-0.9的加热温度作为最低温度，挑选出大部分蛋白质发生较明显沉淀的温度点作为最适温度区间，即最低温度至最高温度区间，通常为47-60℃。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

步骤(a)所述的配基分子可以是活性药物、代谢物、核酸分子、金属离子、肽段、蛋白质以及其它可能与蛋白质混合物中的蛋白质发生相互作用的各类分子中的一种或二种以上。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

步骤(a)所述的蛋白质溶液被平均分为两组，其中一组加入一定终浓度的配基分子作为配基组，另一组加入等体积的空白溶剂作为空白组，进行孵育；但不局限于两组，配基组也可以加入一系列不同终浓度的配基，空白组也可以是结构相似的分子或空白。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

步骤(d)所述的定量蛋白质组学分析方法包括无标记定量或分别标记定量，可根据实际样品数目选择合适的定量方法。

8.根据权利要求2或7所述的方法，其特征在于：

步骤(e)所述的数据处理方法具体为：对质谱分析得到的raw文件使用蛋白质组学分析软件进行搜库，设置相应的定量方法；对于得到的定量结果，挑选出定量结果可信度较高的蛋白质，进行归一化处理；直接计算蛋白质在加入配基组和空白组的定量值的差异，设置合适的筛选条件(大于0.15～0.2或小于-0.6～-0.4)，通过所设定的筛选条件的蛋白即为配基分子潜在的靶蛋白。