[发明专利]一种无歧视的蛋白质热稳定性分析方法

说明书

本发明涉及一种无歧视的蛋白质热稳定性分析方法用于筛选与配基分子有相互作用的靶蛋白。取蛋白质样品，分别加入和不加入配基分子进行孵育后，进行加热，分离上清液进行酶解和定量蛋白质组学分析，计算配基组和空白组的蛋白质定量结果的差异筛选出配基靶蛋白。本发明只在绝大多数蛋白质的热稳定性有较大变化的温度点进行实验，省去了对配基分子靶蛋白鉴定没有意义的温度点，直接计算配基组和空白组的蛋白质的差异而不去拟合曲线计算ΔTm，更加直观地反映出靶蛋白在加入配基组质和空白组的蛋白质热稳定性的不同，也可以避免很多具有不规则熔化曲线的靶蛋白因无法计算ΔTm而被遗漏，适用于所有对热有响应的蛋白质，提高了靶蛋白鉴定的覆盖度。

技术领域

本发明属于蛋白质组学研究方向蛋白质与配基分子相互作用技术领域，具体涉及一种高灵敏度高覆盖度的配基靶蛋白的鉴定方法及其应用。

背景技术

药物分子靶蛋白和脱靶蛋白的全面精准鉴定一直是药物研究领域一个重大的挑战。近年来，随着质谱技术的高速发展，几种基于质谱的蛋白质组学技术开始被应用到药物分子靶蛋白的鉴定中去。除了具有较高的通量之外，这些技术在不需要对药物分子进行任何修饰的情况下，可以较好的鉴定出药物分子的直接靶蛋白和间接靶蛋白。其中包括：药物亲和力响应靶点稳定性方法(DARTS)(Target identification using drug affinityresponsivetarget stability(DARTS),Proc.Natl Acad.Sci.USA.106,21984–21989(2009))、限制性酶切方法(LIP)(A Map of Protein-Metabolite Interactions RevealsPrinciples of Chemical Communication，Cell,172,358-372.e23(2018))、蛋白质氧化速率稳定性方法(SPROX)(Thermodynamic analysis of protein-ligand bindinginteractions in complex biological mixtures using the stability of proteinsfrom rates of oxidation.Nat.Protoc.8,148–161(2013))和蛋白质热稳定性分析方法(TPP)(Tracking cancer drugs in living cellsby thermal profiling of theproteome，Science,346,1255784(2014))。前三种方法的主要缺点是需要鉴定并定量到特定的肽段，由于蛋白质动态范围和质谱鉴定的影响，这是相当困难的。

蛋白质热稳定性分析方法利用药物分子的靶蛋白在结合药物分子前后热稳定性的不同，从而在相同温度下加热之后沉淀出来的蛋白质的量不同，再结合质谱定量技术寻找差异蛋白即为潜在的靶蛋白。蛋白质热稳定性分析方法被广泛应用于蛋白质和药物分子、蛋白质和代谢物、蛋白质和核酸、蛋白质和蛋白质等之间的相互作用研究。但是传统的热蛋白质分析方法无论是在实验过程方面还是数据处理方面都存在着比较明显的缺陷。实验组和对照组被分为不同的样品，后续处理和质谱定量过程容易带来较大的影响等。利用了一些蛋白质热稳定性没有明显变化的冗余的温度点，仅仅是为了处理数据时去拟合“S”形熔化曲线计算ΔT_m，但是对于很多没有规则的融化曲线的蛋白质根本无法拟合出“S”形曲线计算ΔT_m从而被遗漏，是一种有歧视的方法。

实际上在筛选靶蛋白时，真正有意义的是那些能够引起加药组和对照组蛋白质热稳定性发生差异的温度范围，并且这些差异本身才能真正反映结合药物分子前后靶蛋白热稳定性的变化程度，而不是传统方法拟合曲线之后所计算出的ΔTm。

针对以上问题，我们拟发明一种更加简单并且鉴定灵敏度和覆盖度更高的配基靶蛋白鉴定的方法。

以上文献对基于无歧视的蛋白质热稳定性分析方法未作任何记载，也未作任何启示。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高灵敏度、高覆盖度的配基分子靶蛋白鉴定的方法。