[发明专利]核苷酸序列、通用反向引物、通用反转录引物及miRNA检测方法

说明书

本发明提供一种具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列、具有SEQ ID NO:2的通用反向引物、通用反转录引物以及miRNA检测方法。在miRNA检测方法中，使用所述通用反转录引物对miRNA样品进行cDNA合成，而所述通用反向引物用于在qPCR定量检测时进行所述cDNA分子扩增。

本发明是2016年6月1日所提出的申请号为2016103826313、发明名称为《核苷酸序列、通用反向引物、通用反转录引物、引物设计方法及miRNA 检测方法》的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种核苷酸序列、通用反向引物、通用反转录引物及miRNA 检测方法，尤其涉及一种应用于miRNA检测、定量和表达谱分析的核苷酸序列、通用反向引物、通用反转录引物及miRNA检测方法。

背景技术

miRNA为高度保守的非编码RNA，长度约为18-25个核苷酸，其能够调控生物体的基因表现。近年来，研究结果显示miRNA与许多疾病相关，特别是癌症，miRNA具有致癌基因或抑癌基因的作用，在人类癌症的病理生理学中扮演重要角色。更详细而言，miRNA在癌症病例中的表现情形，可作为癌症诊断和预后判断的工具，甚至能够进一步预测病患的存活率，已成为新一代的癌症生物标记(Biomarker)。此外，也基于健康个体与癌症病患之间的miRNA表现差异，发展出各种癌症诊断工具。因此，用于miRNA检测、定量和表达谱分析(expression profiling)的材料和方法是重要且关键的。

在现有技术中，检测与定量miRNA的方法包括北方墨点杂交法(Northern blothybridization)、转殖技术(cloning)、微阵列基因芯片分析及次世代定序技术。相较于现有技术，即时定量反转录聚合酶链锁反应(qRT-PCR，quantitative real-time reversetranscription PCR)方法具有较高的敏感度及特异性。

目前已发展出各种不同的qRT-PCR方法，这些方法主要可分成以下两种。第一种方法是使用茎环反转录引物(stem-loop RT primer)进行cDNA合成，并使用miRNA特异性探针(miRNA specific probe)或通用探针(universal probe) 对miRNA进行定量。第二种方法则是使用线性的通用反转录引物(universal RT primer)进行cDNA合成，并使用miRNA特异性正向引物(miRNA specific forward primer)、反转录引物特异性反向引物(RT-primerspecific reverse primer)以及双股DNA结合染料(double-stranded DNA intercalatingdye)进行 miRNA的定量。

针对上述qRT-PCR方法，第一种方法的反转录引物因含有一个茎环结构，具有较佳的特异性，但所使用的miRNA特异性探针或通用探针的成本较高。第二种方法不需使用探针，因此，可进一步降低成本。然而，第二种方法所使用的线性通用反转录引物的特异性较第一类的茎环反转录引物差，且目前市售的通用反转录引物可能需要进一步修饰。

基于上述，如何提升线性通用反转录引物及反向引物的特异性及敏感度，同时兼具降低成本及方便使用的特性，以检测、定量和分析miRNA的表现量，为目前所需改良的重要课题。

发明内容

本发明提供一种核苷酸序列、通用反向引物、通用反转录引物及引物设计方法，适用于miRNA检测、定量和表达谱分析的qRT-PCR方法，其中通用反向引物、通用反转录引物以及由引物设计方法所设计出的引物具有较佳的特异性及敏感度，同时兼具降低成本及方便使用的特性，且不需对引物进行额外的核酸修饰(oligonucleotide modification)。

本发明提供一种具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列，用于设计miRNA qPCR检测所用的正向引物，与反向引物搭配以进行cDNA分子扩增。