[发明专利]一种笔筒树核外DNA快速提取和分析鉴别的方法

权利要求书

1.一种笔筒树核外DNA快速提取和分析鉴别的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)核外DNA的提取

通过裂解液提取破除细胞壁后的笔筒树植物样品中的总DNA，再通过0.45μm的微孔径滤膜过滤实现去除细胞核基因组，得到包括mtDNA和cpDNA在内的核外DNA；

2)核外DNA的分析鉴别

设计笔筒树mtDNA中atp1基因的特异性引物，其上游引物的序列为SEQ ID NO：01，下游引物的序列为SEQ ID NO：02；

选择植物trnH-psbA基因序列引物，其上游引物的序列为SEQ ID NO：03，下游引物的序列为SEQ ID NO：04；

利用两对引物分别对核外DNA进行PCR扩增并对扩增产物进行测序分析。

2.根据权利要求1所述的一种笔筒树核外DNA快速提取和分析鉴别的方法，其特征在于：1)核外DNA的提取

a)将笔筒树植物样品在液氮中研磨为样品粉末，破除细胞壁；转移样品粉末至离心管，加入65℃预热的裂解液，所述样品粉末与裂解液的用量比为1g：2mL；在65℃水浴30分钟，每5分钟上下颠倒摇晃离心管至均匀，过滤得到含笔筒树总DNA的滤液；

b)使用针筒过滤器通过0.45μm的微孔径滤膜过滤所述含笔筒树总DNA的滤液至离心管，并置于液氮中冻结1小时；随后将滤液室温解冻后，离心管倒置2～3次，8000g转4℃的条件下离心2分钟；转移上清液至新的离心管中，加入两倍体积的-20℃预冷的无水乙醇，于16800g的转速4℃条件下离心5分钟；丢弃上清液后加入洗涤液重新悬浮；将悬浮液以16800g离心一分钟，丢弃上清液后加入TE缓冲液溶解沉淀，-20℃条件下冷冻保存，得到包括mtDNA和cpDNA在内的核外DNA。

3.根据权利要求1或2所述的一种笔筒树核外DNA快速提取和分析鉴别的方法，其特征在于：所述笔筒树植物样品为新鲜的笔筒树叶片。

4.根据权利要求2所述的一种笔筒树核外DNA快速提取和分析鉴别的方法，其特征在于：所述步骤1)的a)中，过滤时使用两层纱布过滤，并使用裂解液冲洗纱布两次。

5.根据权利要求1或2所述的一种笔筒树核外DNA快速提取和分析鉴别的方法，其特征在于：所述裂解液的pH为7.6，配方为350mM的甘露醇、30mM 3-吗啉丙磺酸、1mM EDTA乙二胺四乙酸、50μM PVPP交联聚乙烯吡咯烷酮和11.2μM半胱氨酸。

6.根据权利要求2所述的一种笔筒树核外DNA快速提取和分析鉴别的方法，其特征在于：所述步骤1)的b)中，洗涤液的pH为7.2，配方为300mM的甘露醇、20mM的MOPS和1mM EDTA。

7.根据权利要求2所述的一种笔筒树核外DNA快速提取和分析鉴别的方法，其特征在于：TE缓冲液的pH为8.0，配方为10mM Tris和1mM EDTA。

8.根据权利要求1所述的一种笔筒树核外DNA快速提取和分析鉴别的方法，其特征在于：所述步骤2)中，PCR扩增程序为90℃预变性4分钟，然后进行35个循环，循环程序为94℃变性30秒、55℃退火1分钟35秒、72℃延伸一分钟，最后72℃延伸10分钟。

9.根据权利要求1所述的一种笔筒树核外DNA快速提取和分析鉴别的方法，其特征在于：所述步骤2)中，将PCR的扩增产物在1％琼脂糖凝胶上电泳。

10.根据权利要求1所述的一种笔筒树核外DNA快速提取和分析鉴别的方法，其特征在于：所述核外DNA的A260/A280比值为1.032～1.042，得率为172ng/g～255ng/g。