[发明专利]一种笔筒树核外DNA快速提取和分析鉴别的方法

说明书

本发明公开了一种笔筒树核外DNA快速提取和分析鉴别的方法，通过裂解液提取破除细胞壁后的笔筒树植物样品中的总DNA，再通过0.45μm的微孔径滤膜过滤实现去除细胞核基因组，得到包括mtDNA和cpDNA在内的核外DNA；设计笔筒树mtDNA中atp1基因的特异性引物，选择植物cpDNA‑trnH基因序列引物，利用两对引物分别对核外DNA进行PCR扩增并对扩增产物进行测序分析。

技术领域

本发明涉及一种笔筒树核外DNA快速提取和分析鉴别的方法。

背景技术

已有的线粒体DNA常见提取方法概括起来可分为密度梯度离心法、酶消化法、柱层析法、氯化铯超速离心法、碱变性法、DNase法、Triton法和改进高盐沉淀法等。其中氯化铯试剂昂贵，碱变性法和酶消化法对试验条件的要求十分严格，Triton法的产量低，易降解，密度梯度离心法操作繁杂。改进高盐沉淀法具有简便、经济、易重复等优点，被很多文献认为是较好的提取方法，但是仍然要求较高的操作环境。

目前用于高等植物叶绿体DNA提取的方法主要有DNase I法、蔗糖密度梯度离心法、Percoll梯度法、无水法、高盐低pH法等，许多植物研究中虽然已经应用这些方法，但是仍存在仪器设备要求较高，步骤繁琐，耗时较长等问题。

笔筒树的核外DNA主要指要指线粒体DNA(mtDNA)和叶绿体DNA(cpDNA)，核外DNA的快速提取技术对笔筒树基因库的构建及全测序的完成至关重要。

植物核外DNA鉴别常利用叶绿体或核糖体基因序列，如matK、rbcL、ITS等。植物线粒体存在较大变异性，需费心设计相关的特异性引物。

笔筒树核外DNA的快速提取与分析有利于深入研究植物系统进化以及细胞质基因功能等的科学问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种笔筒树核外DNA快速提取和分析鉴别的方法，解决了上述背景技术中提取步骤繁琐、耗时较长的问题。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供了一种笔筒树核外DNA快速提取和分析鉴别的方法，包括如下步骤：

1)核外DNA的提取

通过裂解液提取破除细胞壁后的笔筒树植物样品中的总DNA，再通过0.45μm的微孔径滤膜过滤实现去除细胞核基因组，得到包括mtDNA和cpDNA在内的核外DNA；

2)核外DNA的分析鉴别

设计笔筒树mtDNA中atp1基因的特异性引物，其中

atp1(F)：TGTAGGAAAGGCCATGCCAG(SEQ ID NO：01)；

atp1(R)：TGCCCTATGCGTTGATTGGT(SEQ ID NO：02)；

选择植物trnH-psbA基因序列引物，其中

psbA(F)：GTTATGCATGAACGTAATGCTC(SEQ ID NO：03)；

trnH(R)：CGCGCATGGTGGATTCACAATCC(SEQ ID NO：04)；

利用两对引物分别对核外DNA进行PCR扩增并对扩增产物进行测序分析。

在本发明一较佳实施例中，1)核外DNA的提取包括如下步骤：

a)将笔筒树植物样品在液氮中研磨为样品粉末，破除细胞壁；转移样品粉末至离心管，加入65℃预热的裂解液，所述样品粉末与裂解液的用量比为1g：2mL；在65℃水浴30分钟，每5分钟上下颠倒摇晃离心管至均匀，过滤得到含笔筒树总DNA的滤液；