[发明专利]一种仿刺参肠道中芽孢杆菌CQN-2相对定量检测方法

权利要求书

1.一种仿刺参肠道中芽孢杆菌CQN-2相对定量检测方法，其特征在于：所述检测方法包括如下步骤：

S1、芽孢杆菌CQN-2特异性检测引物筛选；

S2、荧光定量PCR体系构建及标准曲线制作；

S3、仿刺参肠道中芽孢杆菌CQN-2相对带菌量计算；

所述荧光定量PCR体系构建包括反应体系和反应程序，

所述反应体系为：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10.0μl，gyrA F4/R4或β-actin F/R上下游引物10μM各0.5μl，DNA模板4.0μl，ddH₂O 5.0μl；

所述反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性10s，61℃退火30s，共45个循环；95℃变性10s，65℃退火60s，95℃持续1s；37℃冷却30s；

gyrA F4的引物序列为CGCTACATGCTTGTTGACGGA；

gyrA R4的引物序列为GCACGCCTTCAATGACTTCC；

β-actin F的引物序列为TTATGCTCTTCCTCACGCTATCC；

β-actin R的引物序列为TTGTGGTAAAGGTGTAGCCTCTCTC。

2.如权利要求1所述的仿刺参肠道中芽孢杆菌CQN-2相对定量检测方法，其特征在于：所述步骤S1具体包括：

S11、选取实验所用菌株并提取细菌中的DNA；

S12、将已经测得的芽孢杆菌CQN-2全基因序列设计特异引物与菌株基因序列进行比对分析；

S13、通过PCR扩增筛选出对芽孢杆菌CQN-2具有特异性扩增的引物序列。

3.如权利要求1所述的仿刺参肠道中芽孢杆菌CQN-2相对定量检测方法，其特征在于：所述步骤S2具体包括:

S21、PCR扩增引物纯化；

S22、将纯化后的PCR扩增引物进行荧光定量PCR体系构建并根据公式1计算出对应的DNA分子拷贝数，其中公式1为；

其中6.022×10²³(molecules/mole)为阿伏伽德罗常数，660daltons为单碱基对的平均分子量；

S23、最后以倍比稀释后的DNA分子拷贝数对数值为横坐标，以荧光定量PCR的CT值为纵坐标，构建DNA拷贝数与CT值之间的标准曲线，其中标准曲线方程公式为CT＝K×log DNA拷贝数+C

其中，E为引物扩增效率。

4.如权利要求1所述的仿刺参肠道中芽孢杆菌CQN-2相对定量检测方法，其特征在于：所述步骤S3具体包括以仿刺参肠道组织中提取的总DNA为模板，以仿刺参β-actin为内参基因，以芽孢杆菌CQN-2的gyrA为目的基因，其中，

gyrA基因的拷贝数：

β-actin基因的拷贝数：

相对带菌量＝N_P/N_L

根据制作的标准曲线和荧光定量PCR检测结果，计算出每个样品中芽孢杆菌CQN-2gyrA基因和仿刺参β-actin基因的拷贝数，利用同一样品中测定的CQN-2gyrA基因拷贝数除以对应的仿刺参β-actin基因拷贝数，得到的比值即为相对带菌量，它相当于同样数量的仿刺参肠道组织细胞中检出的芽孢杆菌CQN-2相对数量。

5.如权利要求2所述的仿刺参肠道中芽孢杆菌CQN-2相对定量检测方法，其特征在于：所述步骤S13中所述PCR扩增包括反应体系、初始反应程序以及优化反应程序，

所述反应体系为：DNA模板：2μL；PCR mix：25μL；引物F：2μL；引物R：2μL；ddH2O 19μL，共50μL；

所述初始反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃复性30s，72℃延伸90s，35个循环，最后72℃温育7min，4℃保存；

所述优化反应程序为：筛选出适宜的引物对后，在其他程序相同的情况下，分别将复性退火温度设置为51℃、53℃、57℃、59℃、61℃和63℃进行PCR扩增。