[发明专利]一种仿刺参肠道中芽孢杆菌CQN-2相对定量检测方法

说明书

本发明提供了一种仿刺参肠道中芽孢杆菌CQN‑2相对定量检测方法，过程包括芽孢杆菌CQN‑2特异性检测引物筛选；荧光定量PCR体系构建及标准曲线制作；仿刺参肠道中芽孢杆菌CQN‑2相对带菌量计算，利用芽孢杆菌CQN‑2的gyrA‑4基因与仿刺参的单拷贝基因β‑actin分别设计特异性引物，建立基于SYBR GreenⅠ荧光定量反应体系和PCR技术的仿刺参肠道中芽孢杆菌CQN‑2含量的相对定量检测方法。

技术领域

本发明涉及杆菌检测的技术领域，尤其是涉及一种仿刺参肠道中芽孢杆菌CQN-2相对定量检测方法。

背景技术

芽孢杆菌CQN-2为解淀粉芽孢杆菌，是健康仿刺参肠道中分离得到的益生菌之一，通过饲料添加芽孢杆菌CQN-2投喂仿刺参后，可显著提高仿刺参的增重率和特定生长率，同时可有效提高仿刺参抵御病原菌感染的抗病力。然而，对于投喂后仿刺参肠道中芽孢杆菌CQN-2的定植情况如何，一直未能找到有效的检测方法。

基于上述一系列的问题，遂有以下技术方案的产生。

发明内容

本发明的目的在于提供一种仿刺参肠道中芽孢杆菌CQN-2相对定量检测方法，利用芽孢杆菌CQN-2的gyrA-4基因与仿刺参的单拷贝基因β-actin分别设计特异性引物，建立基于SYBR GreenⅠ荧光定量反应体系和PCR技术的仿刺参肠道中芽孢杆菌CQN-2含量的相对定量检测方法。

为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供的一种仿刺参肠道中芽孢杆菌CQN-2相对定量检测方法，所述检测方法包括如下步骤：

S1、芽孢杆菌CQN-2特异性检测引物筛选；

S2、荧光定量PCR体系构建及标准曲线制作；

S3、仿刺参肠道中芽孢杆菌CQN-2相对带菌量计算。

进一步的，所述步骤S1具体包括

S11、选取实验所用菌株并提取细菌中的DNA；

S12、将已经测得的芽孢杆菌CQN-2全基因序列设计特异引物与菌株基因序列进行比对分析；

S13、通过PCR扩增筛选出对芽孢杆菌CQN-2具有特异性扩增的引物序列。

进一步的，所述步骤S2具体包括

S21、PCR扩增引物纯化；

S22、将纯化后的PCR扩增引物进行荧光定量PCR体系构建并根据公式1计算出对应的DNA分子拷贝数，其中公式1为；

其中6.022×10²³(molecules/mole)为阿伏伽德罗常数，660daltons为单碱基对的平均分子量；

S23、最后以倍比稀释后的DNA分子拷贝数对数值为横坐标，以荧光定量PCR的CT值为纵坐标，构建DNA拷贝数与CT值之间的标准曲线，其中标准曲线方程公式为

CT＝K×log DNA拷贝数+C

其中E为引物扩增效率。

进一步的，所述步骤S3具体包括以仿刺参肠道组织中提取的总DNA为模板，以仿刺参β-actin为内参基因，以芽孢杆菌CQN-2的gyrA为目的基因，其中，

gyrA基因的拷贝数：

β-actin基因的拷贝数：

相对带菌量＝N_PN_L