[发明专利]一种提高猪克隆胚胎发育效率的方法

说明书

本发明属于动物体细胞克隆方法领域，具体涉及一种提高猪克隆胚胎发育效率的方法。本发明方法主要构思是联合调控克隆早期胚胎的组蛋白泛素化、组蛋白H3第9位赖氨酸上三甲基化(H3K9me3)和组蛋白H3第4位赖氨酸上三甲基化(H3K4me3)修饰程度以提高猪克隆胚胎发育效率的方法；所述联合调控指同时降低组蛋白泛素化、H3K9me3和H3K4me3修饰程度。本发明的方法主要操作方法为：获得猪体细胞克隆胚；获得外源mRNA；将外源mRNA导入克隆胚。本发明的方法同时过表达USP29、KDM4A和KDM5B基因，极显著提高了猪克隆胚胎发育的囊胚率和囊胚内总细胞数，并且使克隆猪的出生效率提高3.82倍。

技术领域

本发明属于动物体细胞克隆方法领域，具体涉及一种基于联合调控组蛋白泛素化、组蛋白H3第9位赖氨酸上三甲基化(H3K9me3)和组蛋白H3第4位赖氨酸上三甲基化(H3K4me3)修饰程度以提高猪克隆胚胎发育效率的方法。

背景技术

体细胞克隆又称体细胞核移植，是指将动物体细胞的细胞核注射到去核的卵母细胞中，从而形成重组的克隆胚胎，并使之恢复细胞分裂，在特定的发育时期将克隆的胚胎移植入母体的子宫，完成全期发育后产生与供体细胞基因型完全相同的子代的过程。该技术在复制优良种畜、生产转基因家畜、制备动物疾病模型和分离人的胚胎干细胞等农业和医学应用上都有巨大的应用价值。目前已经成功克隆出羊、牛、小鼠、猪、兔和马等超过20种哺乳动物，但该技术仍存在一些未解决的问题，包括克隆动物的出生效率低下和器官生理异常等。大多数克隆胚胎在妊娠期死亡，只有约1％的克隆胚胎能够完成全期发育，而且出生后的克隆动物也存在大量的异常表型和发育缺陷，主要包括肺部发育不全、免疫缺陷、大舌头和早衰等，克隆效率低下严重阻碍了该技术的应用。

目前认为克隆胚胎发育异常是体细胞基因组在卵母细胞质中经历的去分化、恢复全能性及启动胚胎发育过程中的表观遗传重编程异常造成的。表观遗传修饰是指非基因序列改变导致基因表达水平的变化，这种变化可通过减数分裂或有丝分裂遗传。表观遗传修饰主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA调控。

哺乳动物的体细胞重编程障碍是由多种形式的抑制性染色质调控共同作用的结果。近年来最早在小鼠的克隆技术研究中发现组蛋白赖氨酸甲基化在体细胞克隆植入前胚胎发育的重编程过程中起到重要调控作用。2014年，张毅等通过对供体细胞和2-细胞胚胎进行转录组测序，发现在小鼠供体细胞基因组的异染色质中H3K9me3偏高的染色体区域的基因没有被激活是小鼠克隆胚胎早期发育停滞的主要原因(Matoba et al.,2014)。2016年，高绍荣教授课题组的研究人员发现组蛋白H3K9me3去甲基化酶基因KDM4B和H3K4me3去甲基化酶基因KDM5B表达异常分别对2-细胞和4-细胞期的小鼠克隆胚胎发育阻滞起到关键作用。通过导入外源性的组蛋白甲基化和组蛋白去甲基化相关的酶能一定程度上调节其含量及分布，通过下调异常高水平的组蛋白H3K9me3和H3K4me3能够大幅度地促进小鼠克隆胚胎的合子激活、胚胎发育以及克隆后代的出生效率(Liu et al.,2016)，这也为改善其他类型哺乳动物的克隆效率提供了一种有前景的方法。中国科学院广州生物医药与健康研究院赖良学课题组的研究人员发现主动下调克隆胚胎中H3K9me3水平，可以显著地提高猪早期克隆胚胎发育效率，但向猪克隆胚胎中注射H3K9me3去甲基化酶KDM4A来下调H3K9me3水平，并不能像小鼠那样提高克隆效率，反而导致猪克隆胚胎在体内发育能力变低，克隆猪出生效率并未提高，在克隆猪的生产上没有应用价值(Ruan et al.,2018)。

泛素化也是组蛋白翻译后修饰的方式之一，对生物体内的转录调控、染色质重塑和DNA损伤修复等多方面的生理活动均存在调控作用，近年来去泛素化酶被不断发现在基因表达的调控中也发挥着重要的作用。目前已发现十多种组蛋白H2A和H2B的特异性位点的去泛素化酶，研究已表明其中部分种类的去泛素化酶还参与调控组蛋白赖氨酸甲基化以及DNA甲基化水平，因此可能也对克隆胚胎早期发育存在重要的调控作用(Pinto-Fernandezand Kessler,2016)，但目前通过调节组蛋白泛素化修饰对猪克隆胚胎发育潜能的影响尚未见相关报道。

发明内容