[发明专利]一种果实高固形物含量的番茄材料的创制方法

权利要求书

1.一种运用CRISPR/Cas9基因编辑系统创制果实高固形物含量的番茄材料的方法，其特征在于：在SIVPE5基因如SEQ ID NO.1所示的第一个外显子和第二个外显子上设计两个gRNA靶位点，第一个gRNA靶位点的序列为：5’-TCGGAAGCTTCCAGATTCTT-3’如SEQ ID NO.2所示；第二个gRNA靶位点的序列为：5’-TGCGTATCAGCTATTGAGAA-3’，如SEQ ID NO.3所示。

2.一种运用CRISPR/Cas9基因编辑系统创制果实高固形物含量的番茄材料的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）通过酶切-连接，将两个gRNA，如SEQ ID NO.2所示和SEQ ID NO.3所示；整合到已构建好的植物表达载体pCGR1301-CRISPR/Cas9中，得到pCGR1301-CRISPR/Cas9-gRNA载体；

（2）将pCGR1301-CRISPR/Cas9-gRNA表达载体导入农杆菌中，得到pCGR1301-CRISPR/Cas9-gRNA农杆菌，所述的CRISPR/Cas9骨架载体为pCGR1301

（3）以含SIVPE5基因的低固形物含量的番茄为材料，用pCGR1301-CRISPR/Cas9-gRNA农杆菌侵染其外植体下胚轴组织，所述的农杆菌为根瘤杆菌GV3101；

（4）诱导愈伤组织，经卡纳霉素抗性筛选，得到转基因阳性植株；

（5）获得阳性转基因株系后，经基因靶位点PCR扩增、测序、外源基因插入分析和突变体表型验证为阳性的纯合株系，即为完全丧失SIVPE5功能且无外源基因插入的果实高固形物含量的突变体；其中第一个靶位点的引物序列为：SIVPE1-F：5’-GCGTAAGATAGCACGAAGGGAT-3’如SEQ ID NO.4所示；SIVPE1-R：5’-AAACGAACTAGATCGGAAGAA-3’ 如SEQ ID NO.5所示；第二个靶位点的引物序列为：SIVPE2-F：5’-AGAATGGAATAAACCGGCTCT-3’ 如SEQ ID NO.6所示；SIVPE2-R：5’-CATCTCCCGTGTAATCCTGAC-3’ 如SEQ ID NO.7所示。