[发明专利]一种果实高固形物含量的番茄材料的创制方法

说明书

本发明属于植物基因工程领域，具体公开了一种运用CRISPR/Cas9基因编辑系统创制果实高固形物含量的番茄材料的方法。包括步骤：（1）对控制番茄固形物的基因SIVPE5进行序列分析，确定特异的sgRNA序列；（2）构建含有sgRNA和Cas9蛋白的表达载体；（3）利用农杆菌侵染法将重组载体转化到果实低固形物含量的番茄中，获得T0代转基因番茄植株；（4）将SIVPE5基因序列发生突变的T0代植株种植于温室，自交获得T1代植株，从T1代中筛选不含有外源转基因成份但SIVPE5基因发生纯合突变且果实固形物含量高的植株，即为果实高固形物含量的番茄材料。本方法成本低，缩短创制周期，一年之内即可获得果实高固形物含量的番茄材料，且该番茄材料不含有外源基因，安全无风险。

技术领域

本发明属于植物基因工程和基因遗传修饰领域，具体涉及一种果实高固形物含量的番茄材料的创制方法。

背景技术

番茄(Solanum lycopersicum)是重要的蔬菜和经济作物，在世界范围内广受欢迎。我国是鲜食番茄第一大生产国，也是加工番茄的第三大生产国，在世界番茄市场中具有举足轻重的地位。近年来，由于经济原因及品质问题，我国番茄酱的出口量有所大幅减少，加工番茄栽培面积也萎缩严重。可溶性固形物(TSS,Total Soluble Solids)含量是衡量番茄果实品质的重要指标，其主要成分为可溶性糖，还有少量有机酸和氨基酸等。由于甜度是果实重要的风味特性，而甜味主要是由含糖量决定，因此，TSS也成为决定鲜食番茄风味品质的重要指标。除影响风味外，TSS含量也是影响加工番茄番茄酱的生产成本。研究表明，生产浓度为28％的番茄酱，如果加工番茄的TSS含量从4％提高到5％，将减少原料消耗约25％。我国加工番茄现有品种的TSS含量大部分在4.0-5.0％，多数地区还使用老品种，而美国等发达国家早已使用新品种，平均TSS含量可达到5.5％。因此，提高番茄TSS含量，不仅可以改善鲜食番茄的风味品质，还可提高加工番茄的生产效率，增强我国番茄加工产品在国际市场上的竞争力。

目前，通过传统回交的方法将一个低固形物含量的自交系改良成高固形物含量的自交系，一般需要至少7代才能转育成功，包括1代杂交，至少5代的回交和1次自交，按一年种植2代计算，至少需要3年半的时间才能完成。基因靶向编辑技术(gene targetedediting)是一种可以在全基因组水平对DNA序列进行改造编辑的遗传操作技术。CRISPR/Cas9基因编辑技术是继TALEN基因编辑技术之后又一重大突破。该技术通过RNA指导Cas9核酸酶对靶向基因进行特定DNA编辑。CRISPR/Cas9系统的基因编辑效率更高，Cas9系统的载体构建与使用也更加便捷，并已应用在各物种中，是目前使用广泛的基因编辑技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种运用CRISPR/Cas9基因编辑系统创制果实高固形物含量的番茄材料的方法，以克服现有技术制备高固形物番茄耗时耗力的不足。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种运用CRISPR/Cas9基因编辑系统创制果实高固形物含量的番茄材料的方法，在SIVPE5基因(如SEQ ID NO.1所示)的第一个外显子和第二个外显子上设计两个gRNA靶位点，第一个gRNA靶位点的序列为：5’-TCGGAAGCTTCCAGATTCTT-3’如SEQ ID NO.2所示；第二个gRNA靶位点的序列为：5’-TGCGTATCAGCTATTGAGAA-3’，如SEQ ID NO.3所示。