[发明专利]一种细胞外囊泡循环分离纯化平台及方法

说明书

本发明涉及一种细胞外囊泡循环分离纯化平台及方法，属于细胞外囊泡分离技术领域。样品管与循环泵连接，循环泵通过至少一个入口与过滤器连接；过滤器中设置有滤膜，滤膜用于截留大于该滤膜孔径的细胞外囊泡，并用于过滤杂质；滤膜用于将截留的部分通过至少一个上出口返回到样品管中，并用于将过滤的部分通过下出口进入收集管。将含有细胞外囊泡样品注入样品管，经循环泵导入到过滤器中，细胞外囊泡被滤膜截留并通过上出口返回至样品管中，而样品中的杂质及小分子穿过滤膜流至收集管，如此循环，就可以逐步富集浓缩样品中的细胞外囊泡，并有效去除背景杂质。将上述平台串联并加载不同孔径滤膜，可以实现不同尺寸下细胞外囊泡高效分离纯化。

技术领域

本发明属于细胞外囊泡分离技术领域，具体涉及一种细胞外囊泡循环分离纯化平台及方法。

背景技术

细胞外囊泡(Extracellular Vesicles,EVs)是具有双层膜结构的纳米级膜囊泡，来源于细胞分泌或细胞膜脱落，直径约为30-2000nm。细胞外囊泡也广泛存在于各种体液中，如唾液、尿液、血液、乳汁、腹水和脑脊液等。其携带有丰富的细胞来源的生物标志物，如蛋白质、脂类、核酸(DNA、RNA)等，是预后循环生物标志物的重要载体；并参与众多细胞关键过程，如细胞间通讯、细胞迁移、血管新生和免疫调节等，此外，细胞外囊泡来源于细胞，具有生物相容性好、低免疫原性及易于生物标记优势，有望作为新型药物载体。因此，细胞外囊泡相关研究具有重要科学价值。

传统分离和纯化细胞外囊泡的方法有超速离心法、超滤法、尺寸排阻色谱法、免疫磁珠法、以及聚乙二醇(PEG)沉淀法。上述方法虽然各有优点，但存在耗时长，产量低以及纯度低等缺点，大大限制了其在临床上的进一步应用。前述可知，细胞外囊泡尺寸在30-1000nm范围，采用对应孔径的纳米膜可以对其进行有效全分离和纯化，借助多级过滤可进一步实现细胞外囊泡尺寸分级，可获取不同的亚型细胞外囊泡。比如，Rho等人首次报道了一种过滤辅助微流控装置，能够快速、灵敏地检测红细胞分泌的细胞外囊泡，对其进行靶向磁性纳米颗粒标记，并利用小型核磁共振系统进行检测，使细胞外囊泡精确定量以及关键分子标记(CD44、CD47、CD55)的检测成为可能(Acs Nano,Dec,2013,7(12):11227-11233)。Woo等人进一步集成两个滤膜，提出了一种快速、无标签、高灵敏度的细胞外囊泡分离和定量微流控平台(Exodisc)(Acs Nano,Feb,2017,11(2):1360-1370)，在30分钟内实现了20-600nm大小胞外囊泡的全自动纯化，回收率达到了95％。与金标准的超离心方法相比，此法获取细胞外囊泡内mRNA高达100倍。Dong等人报道了一种借助纳米结构光子晶体(Photoniccrystals,PC)荧光增强特性和双过滤分离单元的微流控集成芯片进行了细胞外囊泡的超敏检测，检测线低至8.9×10³细胞外囊泡/mL(Lab on a chip,Sep 7,2019,19(17):2897-2904)。最近，Utkan Demirci等人则报道了一种基于纳米膜过滤的全细胞外囊泡分离分析平台(Exosome total isolation chip，ExoTIC)，具有简单、易用、模块化等优点，便于快速从体液(包括血浆、尿液和灌洗液等)中分离得到高纯度的细胞外囊泡，同时可以根据大小对不同种类的癌细胞系细胞外囊泡进行分类(Acs Nano,Nov,2017,11(11):10712-10723)。与传统的超速离心相比，该平台获取细胞外囊泡产量高至1000倍。但上述方法大多借助单一过滤方式，对小体积(5毫升以内)比较有效。一旦样品体积增大至几十毫升甚至几百毫升时，随着过滤时间的延长，滤膜上累积的细胞外囊泡越来越多，过滤效率大大降低，过滤压力也逐步增大，导致滤膜破裂。而载药用的细胞外囊泡，使用量都比较大，目前大多还是借助传统的超速离心法。因此开发一种简单高效，低成本的超高通量，大体积样品下的细胞外囊泡分离及纯化方法尤为必要。在此基础上进一步实现细胞外囊泡尺寸分级，并获取不同的亚型细胞外囊泡对研究潜在信号分子机制及生物标记物都至关重要。

发明内容