[发明专利]一种从重组鸡干扰素α复性液中纯化制备重组鸡干扰素α的方法

说明书

本发明公开了一种从重组鸡干扰素α复性液中纯化制备重组鸡干扰素α的方法，属于生物技术领域，其工艺流程包括重组鸡干扰素α复性液预处理、阳离子交换层析、及镍亲和层析。其特征在于重组鸡干扰素α复性液预处理：调节原液PH至3.0‑3.5。透析液体积/复性液体积＝40，透析时间12‑18h，透析在4℃环境下进行。阳离子交换层析洗脱速度为80‑100μg/mL。镍柱亲和层析：上样前，将阳离子交换层析洗脱液调节PH用1M NaOH调节至PH 7.平衡液PBS配比为：20mM NaH2PO4，0.5M NaCl,pH 7.4。洗脱液为PH 7.0，浓度500mM咪唑。洗脱速度为50‑100μg/mL。本发明方法制备的重组鸡干扰素α纯度＞99.0％，内毒素＜100EU/mL,生物学活性保持在纯化前的99％以上。在显著提升干扰素纯度以及明显去除内毒素的同时，很好的保持其生物学活性。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种从重组鸡干扰素α复性液中纯化制备重组鸡干扰素α的方法。

背景技术

干扰素是一类在同种细胞上具有抗病毒活性的糖蛋白，通过抑制病毒DNA 和RNA的复制达到预防和治疗效果。1957年自Isaacs和Lindenmann发现干扰素以来，干扰素已经显示出了极强的抗病毒、免疫调节活性和广阔的应用前景。由于干扰素具有强大的抗病毒作用，目前有许多研究报道用于治疗家禽病毒性疾病。大量研究结果表明，重组鸡干扰素α在用于防治鸡禽流感、传染性法氏囊炎、传染性支气管炎等病毒性疾病时，具有显著的抗病毒效果。重组鸡干扰素是采用基因工程技术将动物体内天然干扰素基因亚克隆入原核表达载体，继而转入受体细胞，构建工程菌。通过工程菌发酵表达，分离纯化等步骤最终获得的高纯度干扰素产品。

重组鸡干扰素α采用大肠埃希菌作为表达系统进行发酵生产,在纯化前必须通过高压匀浆、超生破碎等方法将工程菌破壁,以释放蛋白，然后对包涵体蛋白进行变性溶解、再复性，因此大量的杂蛋白包括其他小分子杂质会存于复性液中，同时,细胞壁内的脂多糖也大量释放到缓冲液中,达到几万到几十万EU/mL的内毒素,这是重组鸡干扰素α溶液中杂蛋白及内毒素的主要来源。

通用的内毒素去除方法。水溶液中去除内毒素的方法通常有超滤、活性炭吸附、化学降解和柱层析法等,各有优缺点,由于内毒素来源和工艺的多样性,在重组蛋白的内毒素去除时常采用多个工艺过程的结合。

发明内容

本发明的目的是提供一种从重组鸡干扰素α复性液中纯化制备重组鸡干扰素α的方法，以保证产品生物活性的同时，提高纯度、去除其内毒素，提升产品质量指标。

本发明主要通过对复性液预处理(pH调节、透析等)、离子交换层析、亲和柱层析组合的方法,使内毒素在蛋白纯化过程中逐步被去除的同时，最大限度的提高其生物活性回收率，提高收益，降低成本。最终使内毒素含量及蛋白纯度达到质量标准。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种从重组鸡干扰素α复性液中纯化制备重组鸡干扰素α的方法，包括如下步骤：

(1)重组鸡干扰素α复性液预处理：调节所述重组鸡干扰素α复性液原液 pH至2.8-3.2，用35-50倍重组鸡干扰素α复性液体积、浓度为15-25mM的磷酸盐缓冲液，使用截留分子量为7KD的透析袋透析12-18h，经离心弃沉淀，得上清；

(2)阳离子交换层析：①平衡:阳离子柱子用0.015M-0.025M磷酸盐缓冲液平衡；②上样:将所述步骤(1)的上清进行上样；③淋洗：0.015M-0.025M磷酸盐缓冲液淋洗平衡；④洗脱：用浓度为0.5M-1M NaCl、0.015M-0.025M磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集洗脱液；