[发明专利]一类自闪烁罗丹明螺硫酯荧光染料及其合成方法和在超分辨成像领域的应用

权利要求书

1.一类自闪烁罗丹明螺硫酯荧光染料在超分辨成像领域的应用，其特征在于，该荧光染料结构如下：

其中：

R₁和R₂是相同或不同的基团，为H、C_mH_2m+1、C_mH_2m-1、C_6+mH_5+2m、C_mH_2m+1CO、C_mH_2m+1SO₂、C_mH_2m+1PhSO₂中的任一基团；在上述的不同结构通式的化合物或基团中，m是1~20之间的任何整数；n是0~20之间的整数。

2.一种如权利要求1所述的自闪烁罗丹明螺硫酯荧光染料的合成方法，其特征在于，在罗丹明螺硫酯荧光母体的一端通过哌嗪链接Halo蛋白标签的底物分子氯代烷及衍生物，合成路径如下：

。

3.根据权利要求2所述的自闪烁罗丹明螺硫酯荧光染料的合成方法，其特征在于，具体步骤如下：

（1）中间体N,N-二取代酮酸的合成：

将3-羟基-R₁, R₂-基苯胺和邻苯二甲酸酐置于两口烧瓶中，抽真空并用氮气置换三次；在氮气保护下，用注射器向烧瓶中加入甲苯，升温至加热回流8-16 h；冷却至室温后，将反应液倒入水中，抽滤，用少量甲醇洗涤滤饼，得到淡粉色固体将得到的固体用异丙醇进行重结晶，重结晶析出的固体用少量甲醇洗涤，得到淡黄色固体即为化合物1的粗产物，即为中间体N,N-二取代酮酸；

（2）中间体单哌嗪取代罗丹明的合成：

将步骤（1）得到的中间体N,N-二取代酮酸和间羟基苯基哌嗪置于两口烧瓶中，抽真空并用氮气置换3次；在氮气保护下用向烧瓶中注入甲磺酸；在90°C下反应过夜；在冰水浴和搅拌条件下，缓慢将冷却后的反应液加入碳酸钠水溶液中，用pH试纸监测调节溶液呈弱碱性；用二氯甲烷对反应混合液进行萃取，合并后的有机相用无水硫酸钠进行干燥;

通过减压蒸馏除去溶剂后，剩余物用硅胶柱层析进行提纯，得到红色固体即为化合物2，即为中间体单哌嗪取代罗丹明；

（3）中间体Fmoc保护的单哌嗪取代罗丹明的合成：

将步骤（2）得到的中间体单哌嗪取代罗丹明、芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺和无水碳酸钠置于两口烧瓶中，抽真空并用氮气置换3次；在氮气保护下用注入乙腈，在室温下反应6-10 h；通过减压蒸馏除去溶剂后，用乙酸乙酯将粗产物溶解，抽滤，取滤液；用少量水洗涤滤液，有机相用无水硫酸钠进行干燥；除去溶剂后，剩余物用硅胶柱层析进行提纯，得到粉色固体即为化合物3，即为中间体Fmoc保护的单哌嗪取代罗丹明；

（4）中间体Fmoc保护的单哌嗪取代罗丹明螺硫酯的合成：

将步骤（3）得到的中间体Fmoc保护的单哌嗪取代罗丹明置于圆底烧瓶中，加入1,2-二氯乙烷使反应物完全溶解；在搅拌条件下向溶液中滴加三氯氧磷后，升温至回流持续反应6-8 h；通过减压蒸馏除去溶剂后，剩余物用四氢呋喃溶解，并将其缓慢滴加进含有硫脲、四氢呋喃、三乙胺和水的混合溶液中；在室温下搅拌12-20h后除去溶剂，将剩余物加入水中，用乙酸乙酯对水相萃取，合并后的有机相用无水硫酸钠干燥，之后除去溶剂，粗产物用硅胶柱层析进行提纯，得到白色固体即为化合物4，即为中间体Fmoc保护的单哌嗪取代罗丹明螺硫酯；

（5）中间体单哌嗪取代罗丹明螺硫酯的合成：

将步骤（4）得到的中间体Fmoc保护的单哌嗪取代罗丹明螺硫酯置于圆底烧瓶中，向烧瓶中加入二乙胺的乙腈溶液，在室温下搅拌5-10 h；通过减压蒸馏除去溶剂，剩余物用硅胶柱层析进行提纯，得到紫色固体即为化合物5，即为中间体单哌嗪取代罗丹明螺硫酯；

（6）中间体羧酸烷基取代罗丹明螺硫酯的合成：

将步骤（5）得到的中间体单哌嗪取代罗丹明螺硫酯、末端卤素取代的饱和脂肪羧酸、无水碳酸钾和碘化钾置于圆底烧瓶中，加入适量乙腈使固体溶解，加热回流过夜；通过减压蒸馏除去溶剂，剩余物用硅胶柱层析进行提纯，得到紫色固体即为化合物6，即为中间体羧酸烷基取代罗丹明螺硫酯；

（7）自闪烁罗丹明螺硫酯荧光染料的合成：

将步骤（6）得到的中间体羧酸烷基取代罗丹明螺硫酯、1-羟基苯并三唑和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐置于圆底烧瓶中，加入超干N, N-二甲基甲酰胺，在搅拌条件下加入Halo-NH₂和三乙胺，在室温下搅拌2天；通过减压蒸馏除去溶剂后，剩余物用硅胶柱层析进行提纯，得到无色粘稠液体即为自闪烁罗丹明螺硫酯荧光染料。