[发明专利]一类自闪烁罗丹明螺硫酯荧光染料及其合成方法和在超分辨成像领域的应用

说明书

本发明涉及一类自闪烁罗丹明螺硫酯荧光染料及其合成方法和在超分辨成像领域的应用。在罗丹明螺硫酯荧光母体的一端通过哌嗪链接Halo蛋白标签的底物分子氯代烷基衍生物，具体结构如式(1)所示。本发明中的罗丹明螺硫酯荧光染料在细胞内具有无需外加稳定剂、不需要强激活光即可自闪烁的优异性能，适合在活细胞内进行随机光学重构显微成像(STORM)应用。

技术领域

本发明属于荧光染料领域，具体涉及一类自闪烁罗丹明螺硫酯荧光染料在超分辨成像领域的应用。

背景技术

2014年诺贝尔化学奖颁给了三个物理学家：Eric Betzig、Stefan W.Hell和W.E.Moerner，以表彰他们对于发展超分辨荧光成像技术做出的卓越贡献。超分辨光学显微镜将分辨率极限从几百纳米提升到了几纳米。相比于电子显微镜和扫描电子显微镜，超分辨光学以其独特的非侵入性和高度特异性地多色标记，非常适合于活细胞成像，从而使科学家们能够观察到细胞中不同分子在纳米尺度上的运动。

因此，近年来，超分辨荧光成像技术在生物医学领域得到了迅猛发展。相应地，人们对该项技术所依附的灵魂工具---荧光染料的性能也提出了更高的要求。因为，在进行活细胞超分辨成像时，往往需要用到高强度的激光对染料进行激发，在某些时候还需要加入如硫醇等稳定剂以保证成像质量。而以上因素除了会对细胞的生理活性产生一定的影响外，还要求染料的光稳定性和亮度更高，而大部分传统荧光染料无法满足上述要求。

发明内容

本发明目的之一是提供一类自闪烁罗丹明螺硫酯荧光染料，并应用于活细胞超分辨成像。本发明中的罗丹明螺硫酯荧光染料在细胞内具有无需外加稳定剂、不需要强激活光即可自闪烁的优异性能，适合在活细胞内进行随机光学重构显微成像(STORM)应用。

本发明的另一目的是提供一类自闪烁罗丹明螺硫酯荧光染料的制备方法，在罗丹明螺硫酯荧光母体的一端通过哌嗪链接Halo蛋白标签的底物分子氯代烷基衍生物，该方法具有步骤简单、容易分离、原料价廉等优点。

该类自闪烁罗丹明螺硫酯荧光染料具有如下结构：

其中：

R₁和R₂是相同或不同的基团，为H、C_mH_2m+1、C_mH_2m-1、C_mH_2m-3、C_6+mH_5+2m、C_mH_2m+1CO、C_mH_2m+1SO₂、C_mH_2m+1PhSO₂中的任一基团；在上述的不同结构通式的化合物或基团中，m是1～20之间的任何整数；n是0～20之间的整数。

此类自闪烁罗丹明螺硫酯荧光染料的合成路线如下所示：

具体合成步骤如下：

(1)中间体N,N-二取代酮酸的合成：

将3-羟基-R₁,R₂-二乙基苯胺和邻苯二甲酸酐置于两口烧瓶中，抽真空并用氮气置换三次；在氮气保护下，用注射器向烧瓶中加入甲苯，升温至加热回流8-16h；冷却至室温后，将反应液倒入水中，抽滤，用少量甲醇洗涤滤饼，得到淡粉色固体将得到的固体用异丙醇进行重结晶，重结晶析出的固体用少量甲醇洗涤，得到淡黄色固体即为化合物1的粗产物，即为中间体N,N-二取代酮酸；

(2)中间体单哌嗪取代罗丹明的合成：