[发明专利]液相色谱串联质谱定量意蜂蜜MRJP2的方法

说明书

本发明提供一种液相色谱串联质谱定量意蜂蜜MRJP2的方法。本发明筛选出意蜂蜜王浆主蛋白2（MRJP2）的特征肽段，并开发液相色谱串联质谱的定量方法，所述方法包括：筛选特征肽段，制作标准曲线，样品前处理，液相色谱分离以及串联质谱检测，软件定量肽段等步骤。本发明提供的意蜂蜜中MRJP2的定量方法，具有较高的准确度、精确度和灵敏度，且稳定性强，适用于准确定量意蜂蜜中MRJP2。可用于辅助意蜂蜜真实性评价。此外该定量方法对保护蜂蜜消费者的权益和维护蜂产品行业的健康发展具有重要现实意义。

本发明涉及食品检测领域，具体地说，涉及一种液相色谱串联质谱定量意蜂蜜MRJP2的方法。

背景技术

蜂蜜是蜜蜂采集蜜源植物的花蜜或蜜露与其分泌物混合，经过一段时间酿制后形成的一类具有甜味食品。蜂蜜作为传统的天然食品，具有美容、养颜、安神等保健功能，深受百姓喜爱。蜂蜜的生产劳动强度高、周期长、产量易受到蜜源、天气等因素影响，从而导致蜂蜜的生产成本较高，总产量有限，导致市场上的蜂蜜供不应求。一些不法企业为了追逐巨额利润，在蜂蜜的生产、加工、销售等环节，通过掺入蔗糖、转化糖、果糖、葡萄糖、果葡糖浆等制造掺假蜂蜜，严重扰乱了蜂蜜的正常生产及销售秩序。因此加强对蜂蜜真伪鉴别技术的研究是目前亟需开展的工作。

王浆主蛋白2（major royal jelly protein 2，MRJP2），是蜂蜜中的主要蛋白质之一，是蜂蜜中含量比较丰富的蛋白质。研究结果表明MRJP2的含量相对恒定，若是掺入了糖浆等外源性物质，则其含量必定发生较大的变化，因此MRJP2含量可用以辅助鉴别蜂蜜的掺假现象。对于如何准确定量蜂蜜中MRJP2的含量，目前尚无相关报道。

液相色谱串联质谱技术由于其高选择性和高灵敏度，非常适用于复杂生物基质中蛋白质的准确表征、鉴定和定量。通过高分辨质谱的蛋白质定量可以通过将蛋白样品用胰蛋白酶消化后检测整个蛋白质或特征肽段来实现。肽段水平的检测可以通过分析靶蛋白质的序列中的特征肽段来满足定性要求，进而可用于定量。该方法的关键点是为靶蛋白和合适的内标肽段选择一种或多种特异性特征肽段。在此策略基础上，提出本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种液相色谱串联质谱定量意蜂蜜MRJP2的方法。

本发明的另一目的是将该方法用于生产和商业中对蜂蜜的质量控制和真实性鉴定。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种液相色谱串联质谱定量意蜂蜜MRJP2的方法，所述方法包括质谱法检测意蜂蜜中MRJP2的特征肽段，含有以下特征肽段：

特征肽段1：IVNDDFNFDDVNFR；

特征肽段2：GDALIVYQNADDSFHR。

所述方法还包括对蜂蜜样品进行前处理的步骤，前处理使用的试剂包括：

(1)提取缓冲液：0.01 M PBS，pH7.4；

(2)胰蛋白酶液20 ng/μL，溶剂为40mM碳酸氢氨溶液；

(3)特征肽段1、2的标准品。

本发明提供的利用液相色谱串联质谱测定意蜂蜜中MRJP2蛋白含量的方法，包括以下步骤：

A、配制含有固定浓度的稳定同位素内标肽段的不同浓度的特征肽段标准品溶液，进入质谱检测并绘制标准曲线；

B、待测蜂蜜样品的前处理：提取蜂蜜中的蛋白质，用胰蛋白酶液对样品蛋白进行酶切，对酶解产物除盐；

C、向待测样本中添加稳定同位素内标肽段使其浓度与步骤A中的浓度相同，采用相同方法进行液相色谱串联质谱检测；

D、对照标准曲线，获得待测样本中特征肽段的浓度，从而实现对MRJP2的定量检测；

优选地，液相色谱条件如下：