[发明专利]基于Sanger测序的黄热病毒全基因组测序方法、成套引物对和应用

权利要求书

1.一种基于Sanger测序的黄热病毒全基因组测序方法，其特征在于，包括如下步骤：

（a）使用成套引物对对黄热病毒的cDNA进行PCR扩增，得到位于黄热病毒全基因组中不同区域的片段，相邻片段之间含有用于拼接的重叠区域；各片段拼接后的全序列覆盖黄热病毒全基因组全长；

（b）回收各片段的PCR扩增产物；

（c）使用Sanger双脱氧链终止法对步骤（b）的PCR扩增产物进行测序，然后对测序序列进行拼接，得到黄热病毒全基因组序列；

所述成套引物对包括如下引物对：

引物YFV F1和引物YFV R1；引物YFV F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；引物YFV R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

引物YFV F2和引物YFV R2；引物YFV F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；引物YFV R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

引物YFV F3和引物YFV R3；引物YFV F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；引物YFV R3的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

引物YFV F4和引物YFV R4；引物YFV F4的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；引物YFV R4的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

引物YFV F5和引物YFV R5；引物YFV F5的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；引物YFV R5的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

引物YFV F6和引物YFV R6；引物YFV F6的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；引物YFVR6的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

引物YFV F7和引物YFV R7；引物YFV F7的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；引物YFVR7的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；

引物YFV F8-1和引物YFV R8-1；引物YFV F8-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；引物YFV R8-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；

引物YFV F8-2和引物YFV R8-2；引物YFV F8-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；引物YFV R8-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；

引物YFV F9-1和引物YFV R9-1；引物YFV F9-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；引物YFV R9-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；

引物YFV F9-2和引物YFV R9-2；引物YFV F9-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；引物YFV R9-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；

引物YFV F9-3和引物YFV R9-3；引物YFV F9-3的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示；引物YFV R9-3的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示。

2.根据权利要求1所述的黄热病毒全基因组测序方法，其特征在于，PCR扩增的退火温度为52~58℃。

3.根据权利要求2所述的黄热病毒全基因组测序方法，其特征在于，PCR扩增的退火温度为为54~56℃。

4.根据权利要求3所述的黄热病毒全基因组测序方法，其特征在于，PCR扩增的退火温度为55℃。

5.根据权利要求1所述的黄热病毒全基因组测序方法，其特征在于，提取黄热病毒的RNA，经反转录后得到所述黄热病毒的cDNA。

6.根据权利要求4所述的黄热病毒全基因组测序方法，其特征在于，提取黄热病毒的RNA，然后消化提取得到的RNA中残留的DNA，RNA经反转录后得到所述黄热病毒的cDNA。

7.根据权利要求6所述的黄热病毒全基因组测序方法，其特征在于，先纯化经消化处理的RNA，再反转录后得到所述黄热病毒的cDNA。

8.根据权利要求7所述的黄热病毒全基因组测序方法，其特征在于，所述纯化包括磁珠纯化。