[发明专利]基于Sanger测序的黄热病毒全基因组测序方法、成套引物对和应用

说明书

本发明提供了一种基于Sanger测序的黄热病毒全基因组测序方法、成套引物对和应用，涉及病毒检测技术领域。该方法包括提供黄热病毒的cDNA；然后使用成套引物对对黄热病毒的cDNA进行PCR扩增，得到位于黄热病毒全基因组中不同区域的片段，相邻片段之间含有用于拼接的重叠区域；各片段拼接后的全序列覆盖黄热病毒全基因组全长；使用Sanger双脱氧链终止法对PCR扩增产物进行测序，然后对测序序列进行拼接。该测序方法操作简单，测序结果准确度高，用于检测黄热病毒减毒活疫苗中的毒株可以从基因组的序列水平上保证毒株没有发生突变，毒性没有发生改变，进而确保了疫苗生产的安全性。

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，尤其是涉及一种基于Sanger测序的黄热病毒全基因组测序方法、成套引物对和应用。

背景技术

黄热病是由黄热病毒引起，主要通过伊蚊叮咬传播的急性传染病，临床以高热、头痛、黄疸、蛋白尿、相对缓脉和出血等为主要表现。该病在非洲和南美洲的热带和亚热带呈地方性流行，亚洲尚无本病报告。由于黄热病的死亡率高及传染性强，已纳入世界卫生组织规定之检疫传染病之一。

黄热病毒是第一个被发现的人类病毒病，也是第一个被证实由蚊子进行生物学传播的疾病。黄热病病毒属虫媒病毒B组披膜病毒科，病毒直径22～38纳米，呈球形，有包膜，含单股正链RNA，易被热和常用消毒剂，例如乙醚和去氧胆酸钠等灭活，但在血中能于4℃保存1个月，在50％甘油中于0℃下可存活数月，于-70℃或冷冻干燥条件下可保持活力数年。最初分离的黄热病毒Asibi株通过组织培养弱化成17D株，用以制备减毒活疫苗，预防效果良好。

目前，对于典型病例黄热病的诊断不难，而对于散发的、早期或轻型病例不易确诊，需借助于实验室检查。黄热病疫苗是一种减毒活疫苗，存在疫苗毒株毒性恢复的潜在危险，近年来美国和澳大利亚等国都有接种疫苗发生严重不良反应的报道。因此一种能够检测黄热病毒减毒活疫苗是否发生突变的黄热病毒减毒活疫苗全基因组的测序方法是目前需要的。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种基于Sanger测序的黄热病毒全基因组测序方法，该测序方法操作简单，测序结果准确度高。

本发明的第二目的在于提供一种用于基于Sanger测序的黄热病毒全基因组测序的成套引物对。

本发明的第三目的在于提供一种包含上述成套引物对的试剂盒。

本发明的第四目的在于提供一种上述基于Sanger测序的黄热病毒全基因组测序方法、上述用于黄热病毒全基因组测序的成套引物对或上述试剂盒在检测黄热病毒减毒活疫苗是否发生突变中的应用。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种基于Sanger测序的黄热病毒全基因组测序方法，包括如下步骤：

(a)使用成套引物对对黄热病毒的cDNA进行PCR扩增，得到位于黄热病毒全基因组中不同区域的片段，相邻片段之间含有用于拼接的重叠区域；各片段拼接后的全序列覆盖黄热病毒全基因组全长。

(b)回收各片段的PCR扩增产物；

(c)使用Sanger双脱氧链终止法对步骤(c)的PCR扩增产物进行测序，然后对测序序列进行拼接，得到黄热病毒全基因组序列。

优选地，所述成套引物对包括如下引物对：