[发明专利]一种传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a，拉丁文为Infectious bronchitisvirus，所述传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.10499。

2.权利要求1所述的传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a的构建方法，其特征在于，包括：将纤突蛋白膜外区S1基因插入IBV H120疫苗株mRNA编码区转录调控序列下游，拯救获得传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述纤突蛋白膜外区S1基因来源于QX型传染性支气管炎病毒分离株IBYZ，保藏号为CGMCC No.14682。

4.根据权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)以QX型传染性支气管炎病毒分离株IBYZ的基因组RNA为模板，采用YZS1U上游引物和YZS1L下游引物经RT-PCR，得到含纤突蛋白膜外区S1基因的扩增产物，将所述扩增产物加T处理后连接到pMD19-T载体上，得到质粒pMDYZS1；

所述YZS1U上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述YZS1L下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

2)将pMDTM9质粒用5aU上游引物和5aL下游引物进行PCR扩增，添加6×His标签，得到PCR扩增产物，将所述PCR扩增产物连接到步骤1)得到的质粒pMDYZS1中，得到质粒pMDTM9-YZS1Δ5a；

所述5aU上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述5aL下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

3)将含有IBV H120疫苗株基因组骨架片段的9个重组质粒pMDTM1～pMDTM8、pMDTM10和步骤2)得到的pMDTM9-YZS1Δ5a经BsaI酶酶切，分别得到酶切片段，连接酶切片段后，得到传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a的cDNA；

4)以步骤3)得到的cDNA为模板，RNA体外转录后得到病毒基因组，将所述病毒基因组转染细胞系，得到细胞和细胞上清，将所述细胞和细胞上清接种鸡胚，得到传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a。

5.权利要求1所述的传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a在制备纤突蛋白膜外区S1蛋白中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用包括：将所述传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a经PBS缓冲液稀释后，得到稀释病毒；

将所述稀释病毒接种于鸡胚尿囊腔中，37℃孵化48h后，获取尿囊液；

将所述尿囊液离心，得到上清液，采用Ni-NTA法获得上清液中的纤突蛋白膜外区S1蛋白。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a为传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a的第3代病毒。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a与PBS缓冲液的体积比为0.5～1.5:90～110。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述离心的离心力为4000～6000g，所述离心的时间为8～12min。

10.权利要求1所述的传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a在制备预防鸡传染性支气管炎双价疫苗中的应用。