[发明专利]一种利用TCPP联合CEP探针鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒及应用

权利要求书

1.一种利用TCPP联合CEP探针鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒，其特征在于：包含TCPP储备液、微酸性缓冲液、细胞清洗液、细胞固定液、组织固定液、CEP探针溶液、细胞破膜液、DAPI染色液和PBS溶液。

2.根据权利要求1所述利用TCPP联合CEP探针鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒，其特征在于：所述TCPP储备液以异丙醇溶液为溶剂。

3.根据权利要求1或2所述利用TCPP联合CEP探针鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒，其特征在于：所述微酸性缓冲液包括pH值为5.8-6.5的MES缓冲液。

4.根据权利要求3所述利用TCPP联合CEP探针鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒，其特征在于：所述细胞清洗液包括PBS溶液和Tween 20所组成的PBST溶液。

5.根据权利要求1所述利用TCPP联合CEP探针鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒，其特征在于：所述细胞固定液包括多聚甲醛细胞固定液。

6.根据权利要求1所述利用TCPP联合CEP探针鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒，其特征在于：所述组织固定液是由含体积分数50％乙醇的PBS溶液和聚乙二醇溶液混合制得。

7.根据权利要求1所述利用TCPP联合CEP探针鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒，其特征在于：所述细胞破膜液为含有质量分数0.5％Triton X-100的PBS溶液。

8.权利要求1-7任一项所述利用TCPP联合CEP探针鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒在制备用于鉴定循环肿瘤细胞产品中的应用，所述应用用于非疾病诊断和治疗目的。

9.根据权利要求8所述利用TCPP联合CEP探针鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒在制备用于鉴定循环肿瘤细胞产品中的应用，其特征在于：采用固相染色法，具体包括如下步骤：

(1)采用所述的TCPP储备液配制TCPP工作液；

(2)富集循环肿瘤细胞：采集样本，预处理后用细胞清洗液清洗，得细胞溶液；

(3)原位杂交：向所述细胞溶液中加入组织固定液得到混合液，将混合液涂布于载玻片上，干片，将PBS溶液和细胞固定液混匀后，滴加至载玻片上，避光孵育，PBS溶液清洗，干片，滴加CEP探针溶液，封片，杂交孵育，结束后解封，取下盖玻片，浸入PBS溶液；

(4)TCPP暴露：向步骤(3)处理后的载玻片上滴加细胞破膜液，避光孵育，PBS溶液冲洗后将载玻片浸入25-42℃预热的所述TCPP工作液中，避光孵育，用微酸性缓冲液冲洗载玻片，干片，滴加DAPI染色液，封片；

(5)阅片：封片后一定时间内荧光显微镜扫描成像；

(6)结果判定：a.蓝光通道下，被DAPI染色液染色的细胞呈蓝色，以此判断正常细胞和循环肿瘤细胞总数目；b.在绿光通道下，被TCPP染色的细胞呈绿色，以此判断循环肿瘤细胞总数目；c.橙光通道下，根据橙光通道下橙光数目判断肿瘤细胞的染色体核型。

10.根据权利要求8所述利用TCPP联合CEP探针鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒在制备用于鉴定循环肿瘤细胞产品中的应用，其特征在于，采用液相染色法，具体地包括如下步骤：

(1)采用所述的TCPP储备液配制TCPP工作液；

(2)富集循环肿瘤细胞：采集样本，预处理后用细胞清洗液清洗，得细胞溶液；

(3)TCPP暴露：体积分数95％无水乙醇和体积分数5％的微酸性缓冲液混合，加入所述细胞溶液中，离心，弃上清至0.2mL，加入TCPP工作液，25-42℃暗处孵育，离心，弃上清至0.2mL，混匀，加入微酸性缓冲液补足，离心，弃上清至100μL，加入100μL组织固定液，混匀，涂布于载玻片上，干片；

(4)原位杂交：将PBS溶液和细胞固定液混匀后，滴加至载玻片上，避光孵育，PBS溶液清洗，干片，滴加CEP探针溶液，封片，杂交孵育，结束后解封，取下盖玻片，浸入PBS溶液，干片，滴加DAPI染色液，封片；

(5)阅片：封片后一定时间内，荧光显微镜扫描成像；

(6)结果判定：a.蓝光通道下，被DAPI染色液染色的细胞呈蓝色，以此判断正常细胞和循环肿瘤细胞总数目；b.在绿光通道下，被TCPP染色的细胞呈绿色，以此判断循环肿瘤细胞总数目；c.橙光通道下，根据橙光通道下橙光数目判断肿瘤细胞的染色体核型。