[发明专利]RUNX3过表达、PD-1敲减的CAR表达载体的构建方法和应用

权利要求书

1.一种RUNX3过表达、PD-1敲减的CAR慢病毒载体质粒，其特征在于，所述载体质粒为pLVX慢病毒载体质粒，包含人Runx3、PD-1 shRNA、CAR三个部分，所述载体质粒序列如SEQID NO.16所示。

2.根据权利要求1所述的RUNX3过表达、PD-1敲减的CAR慢病毒载体质粒，其特征在于，敲减人PD-1的shRNA模板链序列如SEQ ID NO.10所示核苷酸序列。

3.一种RUNX3过表达、PD-1敲减的CAR慢病毒载体质粒的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)利用化学合成法得到基因片段CA9 CAR-P2A，并利用酶切位点EcoRI和BamHI将基因片段CA9 CAR-P2A克隆至pLVX慢病毒质粒载体；

(2)以pCMV3-RUNX3质粒为模板，利用序列如SEQ ID NO.4所示正向引物和序列如SEQID NO.5所示反向引物进行PCR，扩增序列如SEQ ID NO.6所示基因片段RUNX3，并利用酶切位点BamHI和MluI克隆入(1)中所得载体P2A之后，得到质粒pLVX-EF1a-CA9CAR-P2A-RUNX3；

(3)以pLenti-CRISPR-V2为模板，利用序列如SEQ ID NO.11所示正向引物和序列如SEQID NO.12所示反向引物进行PCR，扩增序列如SEQ ID NO.13所示基因片段U6-shPD1，并利用酶切位点ClaI克隆入上述载体质粒pLVX-EF1a-CA9CAR-P2A-RUNX3，得到质粒pLVX-U6-shPD1-EF1a-CA9 CAR-P2A-RUNX3。

4.一种RUNX3过表达、PD-1敲减的CAR慢病毒载体质粒在生产RUNX3过表达、PD-1敲减的CAR慢病毒中的应用。

5.根据权利要求4所述的RUNX3过表达、PD-1敲减的CAR慢病毒载体质粒在生产RUNX3过表达、PD-1敲减的CAR慢病毒中的应用，其特征在于，所述慢病毒包装和浓缩方法包括以下步骤：

(1)将慢病毒载体质粒与psPAX2包装质粒、pMD2.G包膜质粒共同转染293T细胞，48h和72h后分别收集包含慢病毒的上清液；

(2)将收集的慢病毒上清液装于无菌50mL离心管，在管底加入5mL 20％surcose-PBS溶液，4℃12000g离心4h，管底可见白色病毒颗粒，用适量PBS溶解病毒，4℃复苏24h，分装-80℃保存。

6.根据权利要求4所述的RUNX3过表达、PD-1敲减的CAR慢病毒载体质粒在生产RUNX3过表达、PD-1敲减的CAR慢病毒中的应用，其特征在于，一种RUNX3过表达、PD-1敲减的CAR-Jurkat T细胞，所述CAR-Jurkat T制备方法包括以下步骤：

(1)利用权利要求5所述RUNX3过表达、PD-1敲减的CAR慢病毒感染Jurkat T细胞；

(2)检测Jurkat T细胞CAR、RUNX3表达情况；

(3)检测PD-1 shRNA敲减效率，PD-1 shRNA敲减效率检测方法，包括以下步骤：JurkatT细胞转染PD-1 shRNA慢病毒或对照慢病毒，3天后用10ug/mL PHA和50ng/mL PMA诱导PD-1表达，5天后流式细胞术检测Jurkat T细胞PD-1表达情况，确定PD-1敲减效率。