[发明专利]RUNX3过表达、PD-1敲减的CAR表达载体的构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种RUNX3过表达、PD‑1敲减的CAR表达载体的构建方法和应用，本发明提供了一种RUNX3过表达、PD‑1敲减的CAR慢病毒表达载体的构建和使用方法，本发明提供了利用RUNX3过表达、PD‑1敲减的CAR慢病毒表达载体进行慢病毒包装、浓缩、滴度测定的方法，本发明提供了一种RUNX3过表达、PD‑1敲减的CAR‑Jurkat T细胞，证实了利用该RUNX3过表达、PD‑1敲减的CAR慢病毒表达载体能够生产RUNX3过表达、PD‑1敲减的CAR‑T细胞，PD‑1敲减效率约75％。本发明中过表达RUNX3能帮助实体瘤CAR‑T锚定在肿瘤部位。本发明将RUNX3过表达和PD‑1敲减策略一起加入CAR慢病毒表达载体，并验证了利用该慢病毒表达载体包装的慢病毒能够成功使Jurkat T细胞表达CAR的同时，过表达RUNX3和敲低PD‑1，为后续生产RUNX3过表达、PD‑1敲减的CAR‑T细胞提供了基础。

技术领域

本发明涉及肿瘤免疫治疗技术领域，具体涉及一种RUNX3过表达、PD-1敲减的CAR表达载体的构建方法和应用。

背景技术

CAR-T(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy)即嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，通常指获取肿瘤患者自体T细胞进行改造，体外扩增后回输从而杀伤肿瘤的一种免疫疗法。其基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的single chain antibody fragment,scFv)，是整个CAR-T的核心部件，其他结构包括一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区，跨膜区起到连接细胞内外区域的作用，当scFv与肿瘤抗原结合后，信号即可通过TCRε传导至胞内，产生淋巴细胞活化的生物学效应。CAR-T赋予T细胞以非HLA依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，避免肿瘤细胞通过下调HLA分子的表达逃避免疫攻击。这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标，因而更有利于使用病人自身的免疫细胞来清除癌细胞。

从全球大量开展的CAR-T临床实验来看，CAR-T技术在血液肿瘤、淋巴瘤的治疗上具有令人印象深刻的卓越疗效，而在实体瘤方面，有一些令人鼓舞的突破，但还面临着诸多难点问题需要攻克。这些难点主要包括：缺乏肿瘤细胞特异性表达的抗原，屏障存在使得淋巴细胞不易到达肿瘤组织中，免疫抑制微环境常常导致癌细胞免疫逃逸。因此寻找特异表达在癌细胞表面的膜蛋白抗原，增加肿瘤微环境中效应T淋巴细胞浸润，逆转肿瘤微环境中杀伤性T细胞功能耗竭是实体瘤CAR-T免疫治疗的重点与难点，亦是临床提高肿瘤免疫治疗效果的关键。

RUNX3是RUNX家族的转录因子，能与CBFB结合形成异二聚体核心结合因子(CBF)。RUNX成员通过runt结构域识别DNA结合序列5'-TGTGGT-3'或5'-TGCGGT-3'来调节其靶基因的转录，而CBFB是一个非dna结合调节亚基，它通过变构增强RUNX特异性结合DNA的能力。最近报道显示，RUNX3能够促进淋巴细胞发育成组织滞留记忆T细胞。在CAR-T细胞中过表达RUNX3，促进其发育成组织滞留记忆T细胞，从而利用淋巴细胞组织滞留特性能帮助实体瘤CAR-T锚定在肿瘤部位，这一策略可能解决肿瘤微环境中效应淋巴细胞浸润不足的困境。

PD-1是一种重要的免疫抑制分子，T细胞被激活后会上调PD-1表达，PD-1被肿瘤细胞或其他免疫性(如巨噬细胞)表面的PDL1激活后，会抑制T细胞杀伤功能，诱导效应T细胞耗竭。而且研究显示，过表达RUNX3在促进淋巴细胞组织滞留的同时，也会促进PD-1的表达。在CAR-T细胞中使用敲降PD-1策略，能够抑制PD-1表达，从而延缓通过PD-1途径介导的T细胞功能耗竭，增强CAR-T细胞杀伤能力。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种RUNX3过表达、PD-1敲减的CAR表达载体的构建方法。

本发明的目的是提供一种RUNX3过表达、PD-1敲减的CAR表达载体的构建方法和应用。