[发明专利]一种连翘指纹图谱质量控制体系的建立方法

权利要求书

1.一种连翘指纹图谱质量控制体系的建立方法，包括，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一对照品溶液制备

准确称量2.00mg的对照品，分别置于10mL量瓶中，加入适量50％甲醇溶解，并以50％甲醇定容，得到质量浓度为200μg/mL的对照品贮备液，进样前将对照品贮备液用50％甲醇稀释10倍，上述对照品为连翘酯苷A(111831-200803)，连翘苷(110809-200604)，(+)-表松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷，(+)-松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷；

步骤二供试品溶液制备

取连翘药材粉碎过40目筛，取粉末约1g，精密称定，加入70％甲醇25mL置圆底烧瓶中，称定重量，回流提取30分钟，冷却至室温，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀滤过，取续滤液，即得；

步骤三化合物测定

通过HPLC-TOF/MS正负总离子流色谱图检测对照品溶液、供试品溶液，进行对比分析得出结果；

步骤四指纹图谱的测定

取多批连翘药材作为样本进行指纹图谱研究，将多批药材的指纹图谱的AIA数据文件导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004A版相似度软件，以其中一批连翘药材的指纹图谱为参照图谱，采用多样本平均数矢量综合作为共有模式矢量，时间宽度设定为0.10，多点校正后，确定主要的色谱特征峰，选取峰面积较大、出峰时间适中且稳定的连翘酯苷A峰作为参照峰，计算各色谱峰相对于其的峰面积比，若某一指纹图谱在某相对保留时间处无峰，相对峰面积为零，仍给相应的编号，以保证各色谱指纹图谱都有相同的色谱峰数；

步骤五聚类分析

将各色谱峰占总色谱峰的峰面积量化，得到原始数据矩阵，运用“SPSS软件”对其进行聚类分析，聚类分析将连翘样品分为Ⅰ类和Ⅱ类；

步骤六指纹图谱建立

根据多批连翘药材的聚类分析结果，从中选取归属于Ⅰ类的多批药材的色谱图生成指纹图谱及对照指纹图谱，计算相似度；

步骤七色谱峰的指认

采用对照品结合液质联用法对连翘指纹图谱中的主要特征峰进行指认。

2.根据权利要求1所述的一种连翘指纹图谱质量控制体系的建立方法，其特征在于，步骤三中：

色谱条件为：色谱柱：Orca C185μ250*4.6mm；检测波长：230nm；柱温：35℃。流速：1mL/min；流动相：A-乙腈，B-0.05％磷酸；洗脱方式：梯度洗脱0～15min，5％～15％A，15～65min，15％～40％A，65～80min，40％A～100％A；进样量：5μL；

质谱条件：HPLC条件如前所述，分流比设为1:4。TOF-MS实验条件：正负离子分别进行全扫描(ESI)，扫描质量范围50～1200Da；干燥气的体积流量6L/min，干燥气温度180℃，雾化气压0.8Bar，阳离子模式下，毛细管电压4500V，阴离子模式下的毛细管电压2600V，碎裂电压200Vpp，选择甲酸钠溶液为内标矫正。

3.据权利要求2所述的一种连翘指纹图谱质量控制体系的建立方法，其特征在于，步骤七中：

对照品法：制备芦丁、连翘酯苷A、连翘苷混合对照品溶液，按连翘指纹图谱方法测定，进行比对；

HPLC-Q-TOF法

质谱条件：HPLC条件如前所述，分流比设为1:4，TOF-MS实验条件：正负离子分别进行全扫描(ESI)，扫描质量范围50～1200Da；干燥气的体积流量6L/min，干燥气温度180℃，雾化气压0.8Bar，阳离子模式下，毛细管电压4500V，阴离子模式下的毛细管电压2600V，碎裂电压200Vpp，选择甲酸钠溶液为内标矫正。