[发明专利]一种重组马血清白蛋白及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种重组马血清白蛋白的制备方法，其特征在于，将经过密码子优化的编码马血清白蛋白的核苷酸序列构建入真核细胞诱导表达载体中，然后转入真核细胞进行培养后诱导表达，并进行纯化，从而获得所述重组马血清白蛋白；所述经过密码子优化的编码马血清白蛋白的核苷酸序列是如SEQ ID NO:2所示的序列。

2.根据权利要求1 所述的重组马血清白蛋白的制备方法，其特征在于，所述培养包括预接种的预备步骤。

3.根据权利要求1 所述的重组马血清白蛋白的制备方法，其特征在于，所述真核细胞是酵母细胞。

4.根据权利要求3 所述的重组马血清白蛋白的制备方法，其特征在于，所述细胞是毕赤酵母细胞。

5.根据权利要求4 所述的重组马血清白蛋白的制备方法，其特征在于，所述毕赤酵母细胞是毕赤酵母GS115。

6.根据权利要求1 所述的重组马血清白蛋白的制备方法，其特征在于，所述真核细胞诱导表达载体是分泌表达载体，在所述诱导表达后，离心除去细胞与颗粒物质，取上清进行所述纯化。

7.根据权利要求6 所述的重组马血清白蛋白制备方法，其特征在于，所述分泌表达载体是毕赤酵母表达载体，具体是pHIL-D2表达载体，含有马血清白蛋白表达盒，所用的分泌信号肽为马血清白蛋白自身分泌信号肽。

8. 根据权利要求7 所述的重组马血清白蛋白的制备方法，其特征在于，所述经过密码子优化的编码马血清白蛋白的核苷酸序列按酵母偏好的密码子进行优化, 在起始子前和终止子之后添加EcoR I, 人工合成cDNA表达盒，插入到毕赤酵母表达载体pHIL-D2的EcoRI位点中，构建成ESA马血清白蛋白/ pHIL-D2表达载体；取一定量的pHIL-D2质粒DNA用SalI酶切线性化后，加入到毕赤酵母培养中，用电击法将质粒DNA转入酵母，使其整合到酵母基因组DNA中，用缺组氨酸的培养基筛选获得表达白蛋白的细胞株。

9.根据权利要求1所述的重组马血清白蛋白的制备方法，其特征在于，所述转入真核细胞进行培养后诱导表达，培养采用YPD/YPM培养基，所述YPD/YPM培养基包括1% 酵母提取物，2%蛋白胨 , 以及2%葡萄糖 或 0.5% 甲醇。

10.根据权利要求9所述的重组马血清白蛋白的制备方法，其特征在于，所述培养步骤具体为：挑取克隆，接种到YPD培养基中，30℃、200rpm培养24-72小时；离心去上清，更换培养基为YPM，28℃、200rpm培养24-120小时。

11.根据权利要求10所述的重组马血清白蛋白的制备方法，其特征在于，所述培养步骤具体为：挑取克隆，接种到YPD培养基中，30℃、200rpm培养48小时；离心去上清，更换培养基为YPM，28℃、200rpm培养48-96小时。

12.根据权利要求11所述的重组马血清白蛋白的制备方法，其特征在于，所述培养步骤具体为：挑取克隆，接种到YPD培养基中，30℃、200rpm培养48小时；离心去上清，更换培养基为YPM，28℃、200rpm培养72小时。

13.根据权利要求1或7 所述的重组马血清白蛋白的制备方法，其特征在于，所述诱导表达通过在酵母培养过程中逐步添加甲醇而达到，每隔24小时添加甲醇0.5-1.5%。

14.根据权利要求13所述的重组马血清白蛋白的制备方法，其特征在于，每隔24小时添加甲醇1%。