[发明专利]一种基于不同微生物细胞工厂异源表达酶的快速优化方法

说明书

本发明涉及微生物工程领域，具体涉及一种优化微生物细胞工厂异源表达酶的方法，该方法包括：通过设计程序化实验的方法，分别测定不同外部环境因素下酶表达水平和微生物细胞工厂生长水平，并以最高酶表达水平作为酶参比水平，最高微生物细胞工厂生长水平作为细胞参比水平；选择酶表达水平达到酶参比水平至少90％且微生物细胞工厂生长水平达到细胞参比水平至少70％时的条件作为微生物细胞工厂异源表达酶的优化条件。本发明提供的方法具有综合考虑酶表达特性与宿主细胞生长特性，确定定性定量的生产表达方法，能够实现从菌株构建到生物催化工艺的快速跳跃的优点。

技术领域

本发明涉及微生物工程领域，具体涉及一种优化微生物细胞工厂异源表达酶的方法和应用，特别是常规模式细菌或模式真菌的诱导表达和培养工艺开发，综合考虑酶表达特性与宿主细胞生长特性，确定定性定量的生产表达方法，实现从菌株构建到生物催化工艺的快速跳跃。

背景技术

D-阿洛酮糖是D-果糖在C-3位的差向异构体，是一种自然界中存在含量极少的稀有单糖，其具有热量值极低，与蔗糖甜度相似但吸收率仅为蔗糖的0.3％的特点，故可以作为低热甜味剂替代蔗糖。研究表明，D-阿洛酮糖具有多种营养学和生理学功能，例如可以增强胰岛素耐受性，抑制餐后血糖升高，减少腹内脂肪堆积，且具有预防糖尿病的作用。此外，阿洛酮糖还有抗炎效果，具有保护神经，清除活性氧自由基，以及治疗动脉粥状硬化的作用。在2014年，阿洛酮糖已经被美国食品和药物管理局认定为安全食品(GRAS)。

目前，D-阿洛酮糖的化学合成比较困难，过程副产物较多，尚未有突破性进展。而生物转化方法单一，纯化步骤简单，因此受到科研人员的重点关注。国内外学者对于不同来源的D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPEase)基因进行了克隆表达，D-阿洛酮糖与D-果糖之间的平衡转化率均在30％左右，但异源表达的工艺并没有被详细描述或者系统性研究。江南大学报道了不同梭菌来源的DPEase的菌株构建与酶催化效果，对于DPEase表达的优化仅参考了常规发酵条件，并没有基于DPEase的特性和工程细胞生长特性的结合，系统地优化出(非)诱导培养工艺。中国科学院天津工业生物技术研究所也报道了瘤胃球菌属来源的DPEase在枯草芽孢杆菌体系的异源表达，温度和pH等环境参数并没有综合比较。后来该团队通过全通路代谢工程改造，形成了D-阿洛酮糖直接合成工艺，但菌株稳定性有待验证。

异源蛋白的诱导和非诱导性表达，与菌体生长的特性息息相关，发酵表达水平同时会关系到工程酶的产业化应用，因此快速有效的开发出低成本高表达的培养表达工艺，对于工业酶产品项目的落地转化至关重要。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的酶异源表达优化过程中并未兼顾微生物细胞工厂本身细胞生长特性和酶的表达特性的缺陷，提供一种优化微生物细胞工厂异源表达酶的方法和应用，该方法具有综合考虑酶表达特性和宿主细胞生长特性，快速确定定性定量的生产表达方法，能够实现从菌株构建到生物催化工艺的快速跳跃的特点。

为了实现上述目的，本发明一方面提供一种优化微生物细胞工厂异源表达酶的方法，其特征在于，该方法包括：通过设计程序化实验的方法，分别测定不同外部环境因素下酶表达水平和宿主细胞生长水平，并以最高酶表达水平作为酶参比水平，最高宿主细胞生长水平作为细胞参比水平；选择酶表达水平达到酶参比水平至少90％且宿主细胞生长水平达到细胞参比水平至少70％时的条件作为微生物细胞工厂异源表达酶的优化条件。

本发明第二方面提供上述微生物细胞工厂异源表达酶的优化方法在优化微生物细胞工厂异源表达蛋白中的应用。

通过上述技术方案，本发明所述方法实现了结合酶表达条件与宿主细胞生长条件，优化出不同细胞工厂异源表达DPEase的理想工艺，从而实现从菌株构建到生物催化工艺的快速跳跃。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。