[发明专利]检测与肺癌诊疗相关的外周血循环microRNA的引物及试剂盒

说明书

本发明公开了与肺癌诊疗相关的一组外周血循环microRNA及其应用。所述microRNA包括hsa‑miR‑16‑5p、hsa‑miR‑26a‑5p、hsa‑miR‑15b‑5p、hsa‑miR‑21‑5p、hsa‑miR‑191‑5p、hsa‑miR‑195‑5p、hsa‑miR‑223‑3p、hsa‑miR‑92a‑3p、hsa‑let‑7a‑5p、hsa‑let‑7f‑5p、hsa‑miR‑451a和hsa‑miR‑150‑5p。本发明首先保护上述microRNA特异性检测引物及其在试剂盒中的应用；所述产品的功能为：诊断或辅助诊断肺癌。本发明除了保护特异性引物序列，还包括逆转录引物、特异性上游引物和通用型下游引物；上述microRNA在肺癌外周血中显著上调，具有稳定性好、特异性强、灵敏度高的特点，可以单独或两种以上组合来辅助临床进行肺癌早期诊断或预后监控，具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术和诊断领域，具体地说，涉及外周血循环microRNA辅助诊疗肺癌的方法及其应用。

背景技术

肺癌是目前世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，其中80％～85％为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，5年生存率低于15％。据2014年世界癌症报告显示，肺癌在中国的发病率已经超过全球比例的1/3。分子靶向治疗被认为是特异性最高的肺癌个体化治疗方案。与传统治疗相比，分子靶向治疗具有低细胞毒性和高特异性的特点，通过特异性的载体将药物或抑制剂等选择性地运送到特定的靶细胞、组织或器官内，达到抑制肿瘤细胞生长、增殖或转移的作用，在临床上发挥很好的疗效。在开展分子靶向治疗之前，通常需要采取肺穿刺等方式，获取肿瘤组织样本，进行肿瘤基因型检测。然而肺穿刺对患者造成很大创伤，存在风险。特别是对于不能实施手术的中晚期肿瘤患者，由于组织样本获取困难，严重限制了分子靶向治疗的应用。因此，寻找肿瘤组织替代样本或开发新的肿瘤基因检测方法，对发展分子靶向治疗具有非常重要的临床意义。

microRNA是一类长度为18～25nt的内源性非编码小分子RNA，通过与靶基因mRNA互补结合，调控癌基因或抑癌基因表达，影响肿瘤细胞生长、迁移或侵袭等恶性行为过程。近些年的研究发现，在人外周血中存在一些稳定性良好的循环microRNA(circμlatingmicroRNA)，它们可以与核磷蛋白1(NPM1)、家族蛋白2(Ago2)和高密度脂蛋白(HDL)等物质结合，以复合物的形式存在于外周血中，也可以包含于外泌体(exosome)、微小体和凋亡小体中，从而免受RNase的降解，有望成为肿瘤诊断的新型生物标志物。尤其是循环microRNA来自肿瘤组织exosome、肿瘤微环境中分泌而来，可以反应肿瘤细胞的早期症状、炎症反应等内部信息，并且通过外周血循环的方式进出细胞。通过抽取患者血液，分离循环microRNA，就可以获取病人的疾病信息。因此，外周血循环microRNA是替代组织样本检测分析的非常理想的生物标志物。

综上所述，针对非小细胞肺癌分子靶向治疗由于肿瘤组织获取困难而无法进行基因突变检测的问题，本课题选取中国北方肺癌人群作为对象，探讨利用外周血循环microRNA预测非小细胞肺癌早期诊断、预后监控的可行性，为基因突变检测提供一种新的方法，辅助临床解决肿瘤组织获取困难的实际问题。

发明内容

1.本发明提供了一组适合肺癌早期诊断或预后监测的外周血循环microRNA分子及其应用，该生物分子具有稳定性好，特异性强，易于检测等特点。

2.上述检测与肺癌诊疗相关的外周血循环microRNA的引物，其特征在于：

所述用于检测上述microRNA的引物包含逆转录引物，上游特异性引物和下游通用型引物组合；

其中，逆转录引物(Universal RT primer)所示的单链DNA分子序列如下：5'-GGATCGCCCTTGCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)n-3'；或者将上述核苷酸序列经过一个或几个核苷酸取代和/或缺失和/或添加并且具有相同功能的DNA分子；