[发明专利]Src酪氨酸激酶抑制剂在抑制炎症因子分泌中的应用

权利要求书

1.一种Src酪氨酸激酶抑制剂在抑制炎症因子分泌中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

(1) 培养正常的人单核细胞源巨噬细胞，将人单核细胞源巨噬细胞FABP4过表达后采用Western-blot检测炎症相关通路JAK2/STAT2磷酸化水平；

(2) 培养正常的人单核细胞源巨噬细胞，将人单核细胞源巨噬细胞FABP4过表达后采用Elisa检测炎症因子表达水平；

(3) 将人单核细胞源巨噬细胞FABP4过表达后采用Western-blot检测Src及Src磷酸化水平；

(4) 将人单核细胞源巨噬细胞FABP4过表达后采用酶法检测Src的酶活性；

(5) 将人单核细胞源巨噬细胞FABP4过表达后加入PP2抑制剂采用Western-blot检测通路JAK2/STAT2磷酸化水平；

(6) 将人单核细胞源巨噬细胞FABP4过表达后加入PP2抑制剂采用Elisa法检测人单核细胞源巨噬细胞炎症因子分泌水平。

2.根据权利要求1所述的Src酪氨酸激酶抑制剂在抑制炎症因子分泌中的应用，其特征在于，过表达FABP4引起炎症信号通路激活，炎症因子分泌增加。

3.根据权利要求1所述的Src酪氨酸激酶抑制剂在抑制炎症因子分泌中的应用，其特征在于，过表达FABP4后，Src磷酸化水平增加，激酶活性增加。

4.根据权利要求1所述的Src酪氨酸激酶抑制剂在抑制炎症因子分泌中的应用，其特征在于，用Src酪氨酸激酶抑制剂PP2可以使炎症通路活性减弱，炎症因子分泌减少。

5.根据权利要求1所述Src酪氨酸激酶抑制剂在抑制炎症因子分泌中的应用，其特征在于，巨噬细胞细胞培养方法为：将冻存的细胞从液氮灌中取出后迅速放入37ºC温水的烧杯或者水浴锅中融化，室温离心机1000r/min离心5min，在超净工作台内打开冻存管，将细胞管内冻存液完全倒掉，将剩余液体吸尽，向管内加入含血清的10% 1640培养基，用移液器轻轻将细胞从培养瓶底部吹起后，缓慢将细胞重悬，然后将悬浮的细胞分装至25cm²培养瓶内，再向培养瓶内加入适量10%含血清的培养基，置于37℃、5% CO2的恒温培养箱内培养，单核细胞呈悬浮生长，待到细胞生长至80%-90%时，1000rpm离心5min，传代培养；Control组：给予单核细胞PMA刺激形成巨噬细胞；Ad-GFP组：给予单核细胞PMA刺激形成的巨噬细胞以腺病毒对照组Ad-GFP刺激6h后，换10% 1640培养基培养48h；Ad-FABP4组：给予单核细胞PMA刺激形成的巨噬细胞以Ad-FABP4腺病毒刺激6h后，换10% 1640培养基培养48h；PP2组：给予单核细胞PMA刺激形成的巨噬细胞以PP2刺激2h；Ad-FABP4+PP2组：给予单核细胞PMA刺激形成的巨噬细胞以Ad-FABP4腺病毒刺激6h后，换10% 1640培养基培养48h后用PP2刺激2h。

6.根据权利要求1所述Src酪氨酸激酶抑制剂在抑制炎症因子分泌中的应用，其特征在于，Elisa检测细胞培养液中炎症因子的水平方法为：将细胞培养液收集到离心管中，12000r离心5min，设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度标准品50μl；样品孔中加待测样品10μl，再加稀释液40μl；除空白孔外，标准品孔和样品孔中，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μl，封板膜封闭，37℃水浴锅或恒温箱温育60min；弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次；每孔加底物A、B各50μl，37℃避光孵育5min；每孔加入终止液50μl，15min内，450nm波长处测定各孔的OD值；结果计算：将得到的浓度乘以稀释倍数是实际的炎症因子浓度。