[发明专利]一种乳腺癌临床穿刺样本的解离方法

说明书

本发明公开了一种乳腺癌临床穿刺样本解离的方法，包括样本处理、自然沉降弃上清、离心洗涤、酶解、过筛、裂红洗涤、PBS+10％FBS重悬等步骤。本发明使用自主研发的酶解方案提升了乳腺癌临床穿刺样本的细胞得率，缩短了酶解的时间，提高了细胞的得率。本发明还公开了一种用于乳腺癌临床穿刺样本解离的组织解离液。

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，涉及一种乳腺癌临床穿刺样本解离的方法，具体涉及一种用于提高乳腺癌临床穿刺样本酶解效率的方法。

背景技术

众所周知，肿瘤方面的研究一直是众多科学家关注的热点。然而在多细胞生物中，不同细胞内mRNA的转录水平是有差异的。例如每个人都是从一个受精卵开始逐渐形成囊胚，最终发育成一个完整的个体，与此同时细胞会逐渐分化成免疫细胞，神经元，骨骼肌，上皮细胞等，这些细胞各自转录表达着不同的遗传信息，承担着不同的生理功能。而不同的肿瘤细胞由于发生各种突变，所以不同细胞在基因组和转录组存在着的差异就更大了。这就是所谓的遗传信息的异质性。研究细胞遗传信息的异质性首先需要将组织解离成单细胞悬液。

乳腺癌属于女性群体的高发性癌症，这就凸显了运用乳腺癌的临床样本开展细胞生物学与分子生物学研究的重要性。因此制备出高质量的人乳腺癌临床穿刺样本的单细胞悬液，能为其后续发病机理与药物靶点的研究提供很好的技术支撑。然而乳腺癌穿刺样本组织相对坚硬，导致剪切困难。穿刺样本中油脂含量高，使细胞离心沉降困难且抑制后续的酶解反应。乳腺癌临床穿刺样本较小，解离出4×10⁵数量的单细胞相对困难。文献报道的的酶解方式多为胶原酶III过夜解离，该方法耗时且对细胞的损伤大，易产生大量的死细胞，且过长的酶解时间导致细胞内的转录水平发生变化，不能反映原始样本中细胞真实的转录情况。商品化的美天妮人肿瘤解离试剂盒，解离出的单细胞数量过少，难以满足后续的实验要求。因此解离出高质量的单细胞悬液尚有较大难度。

发明内容

为了克服现有技术存在的上述问题，本发明在进行了大量的深入研究之后，提供了一种提高乳腺癌临床穿刺样本解离的方法。本发明提供的方法包括样本处理、自然沉降弃上清、离心洗涤、酶解、过筛、裂红洗涤、PBS+10％FBS重悬等步骤。本发明通过增加离心洗涤的次数减少油脂残留，采用自主研发的酶液提高酶解效率。

本发明提供了一种乳腺癌临床穿刺样本解离的方法，包括如下具体步骤：

(1)样本处理：取乳腺癌穿刺样本组织块进行PBS冲洗，然后将组织块剪碎；

(2)自然沉降弃上清：向步骤(1)剪碎后的组织块中加入PBS，待组织块自然沉降后弃上清得组织块；

(3)离心洗涤：继续向步骤(2)得到的组织块中加入PBS，离心后去上清得组织块；

(4)酶解：向步骤(3)离心后的组织块中加入DMEM培养基，然后进行酶解得细胞；

(5)过筛：向步骤(4)酶解后的单细胞悬液中加入含FBS的DMEM完全培养基，然后过细胞筛、离心，去除上清；

(6)裂红洗涤：向步骤(5)离心后的细胞沉淀中加入红细胞裂解试剂进行红细胞裂解，然后加入含有FBS的PBS，离心后弃上清；

(7)细胞重悬：向步骤(6)离心后的细胞沉淀中加入含有FBS的PBS进行重悬，镜检后再加入含有FBS的PBS将细胞调整至一定的浓度。

步骤(1)中，所述乳腺癌穿刺样本组织块取自于组织保存液中。

步骤(1)中将样本组织进行PBS冲洗的目的是将穿刺样本上的血液充分洗涤。

步骤(1)中，所述PBS冲洗的次数为0-2次；优选地，为2次。

步骤(1)中，所述PBS优选为预冷的PBS，即，所述PBS的温度为0-10℃；优选地，为4℃。