[发明专利]产羊毛甾醇大肠杆菌菌株的构建方法

权利要求书

1.产羊毛甾醇大肠杆菌菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：根据大肠杆菌密码子优化荚膜甲氧球菌的鲨烯环氧酶的密码子，优化后的序列如SEQ ID NO.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个碱基形成的具有同等功能的核苷酸序列，以优化合成的载体为模板，PCR扩增获得鲨烯环氧酶基因片段；

S2：以提取的酿酒酵母w303基因组为模板，PCR扩增获得NADPH-细胞色素P450还原酶、鲨烯合成酶和羊毛甾醇合成酶基因片段；

S3：通过融合PCR的方法将鲨烯环氧酶、NADPH-细胞色素P450还原酶和羊毛甾醇合成酶基因片段融合成为DNA片段SE-CPR-LS，并将所述SE-CPR-LS片段通过酶切连接的方法克隆到载体pet21c上，构建表达载体pet21c-SE-CPR-LS；

S4：通过PCR扩增的方法将鲨烯合成酶基因片段扩增出来，并将所述鲨烯合成酶基因片段通过同源重组的方法克隆到载体pACYCduet-1上，构建表达载体pACYCduet-SS；

S5：将所述载体pet21c-SE-CPR-LS和pACYCduet-SS通过化学转化方法转化进入大肠杆菌感受态细胞，得产羊毛甾醇大肠杆菌菌株。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

3.一种含鲨烯环氧酶、NADPH-细胞色素P450还原酶和羊毛甾醇合成酶基因片段的表达载体，其特征在于，其序列如SEQ ID NO.13所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个碱基形成的具有同等功能的核苷酸序列。

4.一种含权利要求1中所述鲨烯合成酶基因片段的表达载体，其特征在于，其序列如SEQ ID NO.14所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个碱基形成的具有同等功能的核苷酸序列。

5.含权利要求3中所述表达载体且含权利要求4中所述表达载体的工程菌。