[发明专利]产羊毛甾醇大肠杆菌菌株的构建方法

说明书

产羊毛甾醇大肠杆菌菌株的构建方法，包括：根据大肠杆菌密码子优化荚膜甲氧球菌的鲨烯环氧酶的密码子，PCR扩增获得鲨烯环氧酶基因片段；PCR扩增获得NADPH‑细胞色素P450还原酶、鲨烯合成酶和羊毛甾醇合成酶基因片段并将其融合成为DNA片段SE‑CPR‑LS，将所述SE‑CPR‑LS片段通过酶切连接的方法克隆到载体pet21c上，构建表达载体pet21c‑SE‑CPR‑LS；将所述鲨烯合成酶基因片段通过同源重组的方法克隆到载体pACYCduet‑1上，构建表达载体pACYCduet‑SS；将所述载体pet21c‑SE‑CPR‑LS和pACYCduet‑SS转化进入大肠杆菌感受态细胞，得产羊毛甾醇大肠杆菌菌株。本发明通过外源质粒导入方法改造大肠杆菌BL21(DE3)系统，使其能够合成羊毛甾醇，并通过密码子优化技术提高了外源基因在大肠杆菌系统中的表达量。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种产羊毛甾醇大肠杆菌菌株的构建方法。

背景技术

羊毛甾醇别名异胆固醇，分子式为C₃₀H₅₀O。溶于乙醇、乙醚和氯仿；而在甲醇、丙酮中结晶。羊毛甾醇为无色粉末，具有很多重要的生物活性和广泛的药理作用，如降血压、降血糖、抗癌、治疗白内障等。而且羊毛甾醇还是多种重要的甾醇类物质生物合成的中间体，是化工、医药、食品行业的重要原料。

合成生物学的发展为利用快速生长的微生物来异源表达生物合成基因，提供了一种潜在的生产途径。采用大肠杆菌表达系统具有很多优势，如：遗传操作简单、生长速度快，能在廉价培养基中高密度培养等。具报道(图1)，法尼基焦磷酸(FPP)通过鲨烯合成酶(squalene synthase，SS)催化合成鲨烯(squalene)；而鲨烯通过鲨烯环氧酶(squaleneepoxidase,SE)在 NADPH-细胞色素P450还原酶(NADPH-cytochrome P450reductase,CPR)的辅助作用下可以转化为2,3环氧角鲨烯(2,3-oxidosqualene)；而2,3环氧角鲨烯在羊毛甾醇合成酶(Lanosterol synthase,LS)的进一步催化作用下可以转化为羊毛甾醇。通过将这些合成所需的异源基因在大肠杆菌细胞中表达，就可以利用大肠杆菌胞内已有的法尼基焦磷酸为底物，合成羊毛甾醇。目前，还没有利用大肠杆菌进行羊毛甾醇生物合成的报道。而构建这样一个合成系统，一方面可以直接利用大肠杆菌细胞合成羊毛甾醇，为羊毛甾醇的合成提供一个新的途径；另一方面又可以以该系统为平台细胞，进行以羊毛甾醇为中间体的相关代谢路径的开发和研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种产羊毛甾醇大肠杆菌菌株的构建方法。

为实现上述发明目的，本发明的技术方案具体如下：

产羊毛甾醇大肠杆菌菌株的构建方法，包括以下步骤：

S1：根据大肠杆菌密码子优化荚膜甲氧球菌的鲨烯环氧酶的密码子，优化后的序列如 SEQ ID NO.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个碱基形成的具有同等功能的核苷酸序列，以优化合成的载体为模板，PCR扩增获得鲨烯环氧酶基因片段；

S2：以提取的酿酒酵母w303基因组为模板，PCR扩增获得NADPH-细胞色素P450还原酶、鲨烯合成酶和羊毛甾醇合成酶基因片段；

S3：通过融合PCR的方法将鲨烯环氧酶、NADPH-细胞色素P450还原酶和羊毛甾醇合成酶基因片段融合成为DNA片段SE-CPR-LS，并将所述SE-CPR-LS片段通过酶切连接的方法克隆到载体pet21c上，构建表达载体pet21c-SE-CPR-LS；

S4：通过PCR扩增的方法将鲨烯合成酶基因片段扩增出来，并将所述鲨烯合成酶基因片段通过同源重组的方法克隆到载体pACYCduet-1上，构建表达载体pACYCduet-SS；