[发明专利]一种调控驱动蛋白活性的方法及应用

说明书

本发明公开了一种调控驱动蛋白活性的方法及应用，属于生物技术领域，通过解析酶活性较低的驱动蛋白的晶体结构，通过序列、结构比对和功能验证最终确定酶活性关键调控位点，可用于离体或在体调控驱动蛋白活性。该方法可以有效解决现有技术中无法有效调控(降低与提高)驱动蛋白活性的技术难题，从而为体外或在体研究驱动蛋白功能提供强有力的技术和手段。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种调控驱动蛋白活性的方法及应用。

背景技术

驱动蛋白在癌症、心血管疾病的发生发展中发挥重要作用。驱动蛋白是一类马达蛋白，水解ATP沿微管定向运动，将各种货物(如囊泡、线粒体等)运输至细胞内特定的位置。自1985年首次发现驱动蛋白以来，已经发现14个亚家族的45个成员。随着对驱动蛋白功能研究的逐渐深入，驱动蛋白功能异常与各种疾病(如肿瘤、神经退行性疾病和糖尿病等)的发生发展密切相关。一些驱动蛋白，如Eg5和CENPE等，被证实是有丝分裂的关键因子，而成为肿瘤靶向治疗的热点。2008年，一项前瞻性研究表明，驱动蛋白6(KIF6)基因rs20455位点(W719R)多态性与高加索人群的心血管疾病患病风险相关，而之后的几个大型临床研究也证实了该观点，推测其可能是心血管疾病的一个新的预测因子。这些研究表明驱动蛋白在许多疾病的发生发展过程中发挥重要作用。

但是，目前缺乏调控驱动蛋白酶活性的技术手段，严重限制了驱动蛋白体外或在体功能的研究。目前针对驱动蛋白设计的药物主要集中于Eg5、CENPE等肿瘤相关驱动蛋白，并且主要是抑制剂，导致研究其它驱动蛋白功能缺乏相关药物辅助。大部分驱动蛋白基因敲除后导致胚胎致死，严重限制了在体研究驱动蛋白功能。目前常用两种方法来构建显性负性突变体，过表达从而在体内达到抑制其功能的目的：一种是构建马达区删除突变体，导致突变体不能水解ATP和结合微管；一种是将ATP结合位点关键氨基酸突变，导致突变体能够结合微管但不能水解ATP。然而这两种突变体的构建均只能够降低驱动蛋白酶活性，不能够提高驱动蛋白酶活性。

所以，若能找到一种有效调控(降低与提高)驱动蛋白活性方法，可以为体外或在体研究驱动蛋白功能提供强有力的技术和手段，并将为各种疾病分子机制的探究提供新的技术手段和研究思路。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种调控驱动蛋白活性的方法及应用，该方法可以有效解决现有技术中无法有效调控(降低与提高)驱动蛋白活性的技术难题，从而为体外或在体研究驱动蛋白功能提供强有力的技术和手段。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了一种调控驱动蛋白活性的方法，包括以下步骤：

1)构建驱动蛋白马达区表达载体，然后进行表达和纯化；

2)对构建的驱动蛋白马达区结晶和结构解析；

3)通过对驱动蛋白马达区序列和结构进行比对，获得关键突变位点；

4)构建点突变质粒，然后分别进行野生型和突变体的表达纯化，根据结果，通过突变上述关键位点调控驱动蛋白酶活性。

优选地，通过将关键突变位点突变为不同氨基酸，能够在同一位点增加或降低酶活性。

优选地，所述驱动蛋白为棉花驱动蛋白GhKCH2。

进一步优选地，构建GhKCH2MD不同长度截短片段，经原核表达、纯化得到95％以上纯度的目的蛋白，然后筛选晶体并衍射，获得GhKCH2MD晶体结构。

进一步优选地，棉花驱动蛋白GhKCH2的关键突变位点为Thr494。

进一步优选地，将关键突变位点Thr494突变为丙氨酸，能够构建抑制驱动蛋白活性的显性负性突变体。