[发明专利]毛细管电泳分离检测哺乳动物乳中酸性乳寡糖的方法

说明书

本发明涉及酸性乳寡糖分离检测领域的毛细管电泳分离检测哺乳动物乳中酸性乳寡糖的方法。本发明提供一种用于检测哺乳动物乳中酸性乳寡糖的运行缓冲液，包括缓冲溶液和添加剂，所述添加剂包括甲醇和/或乙腈；所述缓冲溶液的浓度为50‑100mM，pH为7.0‑7.5。本发明还提供毛细管电泳分离检测哺乳动物乳中酸性乳寡糖的方法，包括，预处理以去除哺乳动物乳中的蛋白质和脂肪；然后采用所述运行缓冲液对所述预处理后的哺乳动物乳进行毛细管电泳分析。本发明提供的用于检测哺乳动物乳中酸性乳寡糖的运行缓冲液能够提高酸性乳寡糖的分离度，使酸性乳寡糖有效分离。

技术领域

本发明涉及酸性乳寡糖分离检测领域，具体涉及毛细管电泳分离检测哺乳动物乳中酸性乳寡糖的方法。

背景技术

乳源低聚糖可以促进婴儿大脑发育、增强婴儿记忆力，并且乳源低聚糖还能促进益生菌-双歧杆菌在婴儿肠道内的生长。乳源低聚糖根据组成的不同分为两类：中性乳寡糖和唾液酸化的乳寡糖。中性乳寡糖是人乳中含量最高的一类寡糖，它可以刺激肠道内有益菌的生长、抑制有害菌对小肠上皮细胞的粘附、减少炎症发生、提高机体免疫力，其主要由岩藻糖通过α-1,3，α-1,2糖苷键与葡萄糖、半乳糖、乳糖、N－乙酰氨基葡萄糖等的还原端相连接而成。唾液酸化的乳寡糖作为牛乳中含量最高的一类寡糖，广泛存在于牛乳、羊乳等哺乳动物的乳汁中，其分子结构中含有唾液酸，对婴儿大脑发育具有重要的调节作用，其主要由半乳糖或者乳糖通过α-2,3，α-2,6糖苷键与唾液酸相连接而成。

目前生物方法和化学方法仅能合成低分子量的乳寡糖，部分合成的乳寡糖目前已应用于婴幼儿奶粉中，但其在安全性方面存在争议。因为牛乳寡糖与人乳寡糖有相似成分和相似的生物学功能，因此牛乳寡糖有望成为潜在的母乳寡糖替代物。

目前关于乳寡糖相关研究较少，没有成熟的乳寡糖分离检测技术。而且由于乳寡糖种类多(母乳约有200多种乳寡糖，牛乳约有60多种乳寡糖)，且在成熟乳中含量低，所以检测较为困难。另一方面，由于低聚糖难以与乳糖分离，且在牛乳中乳糖含量远大于低聚糖，在分离检测时会对乳寡糖信号产生干扰，影响检测结果。

发明内容

因此，本发明的目的在于提供毛细管电泳分离检测哺乳动物乳中酸性乳寡糖的方法。

一种用于检测哺乳动物乳中酸性乳寡糖的运行缓冲液，包括缓冲溶液和添加剂，所述添加剂包括甲醇和/或乙腈；

所述缓冲溶液的浓度为50-100mM，pH为7.0-7.5。

所述缓冲溶液为磷酸缓冲溶液或磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液。

所述甲醇和/或乙腈在运行缓冲液中的体积百分比为10-35％。

所述添加剂还包括十二烷基硫酸钠；

所述十二烷基硫酸钠在所述缓冲溶液与十二烷基硫酸钠形成的混合液中的浓度为25-50mM。

本发明还提供毛细管电泳分离检测哺乳动物乳中酸性乳寡糖的方法，包括，

预处理以去除哺乳动物乳中的蛋白质和脂肪；然后采用所述运行缓冲液对所述预处理后的哺乳动物乳进行毛细管电泳分析。

所述预处理方法为，

对哺乳动物乳进行离心，除去上层脂肪和下层沉淀，吸取中间脱脂乳依次进行超滤处理和纳滤处理，收集截留液，旋转蒸发至干燥后用水溶解；

或，

对哺乳动物乳进行离心，除去上层脂肪和下层沉淀，向中间脱脂乳中加入氯仿和乙醇的混合液，混匀后离心，所得上清液加入无水乙醇，于4℃静置6-12h后离心，所得上清液旋转蒸发至干燥后用水溶解。

所述超滤处理的截留分子量为5000-10000Da；

所述纳滤处理的截留分子量为300-500Da；