[发明专利]一种测定GnRH并列体二聚体人工抗原偶联率的方法

说明书

本发明属于生殖类药物技术领域，具体涉及一种测定GnRH并列体二聚体人工抗原偶联率的方法，包括以下步骤：(1)对偶联蛋白以及偶联蛋白样品中残留的GnRH并列体二聚体进行定量测定，得到C_偶联蛋白和C_{残留GnRH并列体二聚体}；(2)对偶联蛋白进行变性还原处理，使得GnRH并列体二聚体发生还原断裂，游离出GnRH并列体单链，对游离态的GnRH并列体单链进行定量测定，得到C_{游离GnRH并列体单链}；(3)计算偶联率：

技术领域

本发明属于生殖类药物技术领域，具体涉及一种测定GnRH并列体二聚体人工抗原偶联率的方法。

背景技术

促性腺激素释放激素(简称GnRH)，最早由Schally等人于1971年从猪和羊的下丘脑中分离出来，具有刺激促黄体生成激素(LH)释放以及促卵泡成熟激素(FSH)分泌的功能，在动物生殖调控中起着重要作用。免疫去势是利用GnRH或其类似物作为抗原对动物实施免疫，使机体产生抗GnRH抗体，与内源GnRH结合，使其失去生物活性，从而抑制性器官的发育达到去势的目的。与传统的手术去势相比，免疫去势可有效防止手术感染情况的发生，具有安全方便、应激小等优势，并且促进动物生长、改善肉质，因此在畜牧生产上具有广阔的应用前景。

自上世纪70年代开始，科学家们对GnRH去势疫苗进行了广泛的研究。他们将GnRH十肽或类似物偶联在牛血清白蛋白(BSA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、卵清蛋白(OVA)等载体蛋白上，在兔、鼠、猴、羊、猪、马、牛等动物上进行免疫实验，实验结果显示，GnRH偶联蛋白对于抑制动物性器官的发育具有明显的作用。90年代，Meloen等人(美国发明专利：US5484592)发明了一种20肽的GnRH并列体，与GnRH单体相比，具有更强的免疫原性。随后，他们又发现将GnRH并列体通过所插入的Cys中的巯基形成二硫键变成二聚体，能够产生比GnRH并列体还要强的免疫原性(US5885966)。专利CN 103554265A和CN 103554228A也公开了一种GnRH并列体二聚体，并将其偶联在卵清蛋白上，实验发现，该偶联蛋白在猪上取得良好的临床效果。

对于偶联蛋白来说，比如结合疫苗，偶联率对于免疫原性强度，也就是偶联蛋白的生物活性，具有重要的影响，是产品最重要的质量属性之一。文献上所采用的多肽抗原偶联蛋白偶联率方法有氨基酸分析对比法、电泳法、质谱法等等。其中氨基酸分析法对于氨基酸组成比例的检测精度不高，通过偶联蛋白和载体蛋白的氨基酸组成比值差异计算偶联率很难得到很准确的结果。偶联蛋白用电泳方法也很难得到准确的分子量，载体蛋白经过人工化学修饰后，或呈现弥散性，或存在一定的迁移偏差，影响分子量的判定。而且，偶联蛋白与天然蛋白相比，在MALDI-TOF-MS中的离子化能力发生一些改变，较难得到理想的结果。

发明内容

本发明针对现有技术中偶联蛋白的偶联率测定方法存在准确度不高的缺陷，提供一种能够准确测定GnRH并列体二聚体(缩写为GnRH-TD)在载体蛋白上偶联率的方法。

本发明的以上目的通过以下技术方案来实现：

一种测定GnRH并列体二聚体人工抗原偶联率的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)对偶联蛋白以及偶联蛋白样品中残留的GnRH并列体二聚体进行定量测定，得到C_偶联蛋白和C_{残留GnRH并列体二聚体}；

(2)对偶联蛋白进行变性还原处理，使得GnRH并列体二聚体发生还原断裂，游离出GnRH并列体单链，对游离态的GnRH并列体单链进行定量测定，得到C_{游离GnRH并列体单链}；

(3)计算偶联率，偶联率的计算公式如下所示：

其中n代表物质的量，单位mol，C代表质量浓度，单位mg/ml，MW代表摩尔质量，单位g/mol。