[发明专利]一种制备非洲猪瘟病毒P30、P54酵母疫苗的方法

权利要求书

1.非洲猪瘟病毒融合蛋白P30-Fcγ、P54-Fcα，其氨基酸序列分别为SEQ No.10、SEQNo.11。

2.表达权利要求1所述蛋白的基因，其特征在于，将ASFV病毒结构蛋白P30编码基因p30与猪免疫球蛋白IgG1的Fc片段编码基因Fcγ串联得到p30-Fcγ编码序列，将非洲猪瘟病毒结构蛋白P54编码基因p54基因与猪免疫球蛋白IgA1的Fc片段编码基因Fcα连接得到p54-Fcα编码序列，其核苷酸序列分别为：SEQ ID No.5；SEQ ID No.6。

3.一种载体，其包含权利要求2所述基因片段。

4.一种酿酒酵母宿主细胞，其包含权利要求3所述的载体。

5.一种非洲猪瘟病毒疫苗株，其特征在于，包括权利要求1所述融合蛋白中的一种或两种。

6.一种制备非洲猪瘟病毒P30、P54酵母疫苗的方法，其特征在于，将非洲猪瘟病毒结构蛋白编码基因p30、p54与Fcγ、Fcα串联，分别构建p30-Fcγ、p54-Fcα在酵母内融合表达的转录单位，经体外酶连、酵母体内转化及同源重组技术，实现2个转录单位串联，并稳定整合入基因组，通过二硫键展示于酵母细胞表面，获得2种单独表面展示P30-Fcγ、P54-Fcα融合蛋白的重组酵母菌株和1种同时表面展示两种融合蛋白的重组酵母菌株，并利用所得菌株制备疫苗。

7.根据权利要求6所述制备非洲猪瘟病毒P30、P54酵母疫苗的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)猪Fcγ、Fcα片段的PCR扩增：采集猪血液并提取血液外周淋巴细胞的总RNA，通过RT-PCR扩增猪IgG1和IgA 1的Fc片段即Fcγ、Fcα；

(2)ASFV病毒结构蛋白的筛选与编码基因的合成：参照NCBI人工合成ASFV病毒结构蛋白P30、P54的编码基因p30(GenBank序列号：MK757460.1)与p54(GenBank序列号：MK276918.1)；

(3)猪Fcγ、Fcα片段和ASFV病毒结构蛋白编码基因的串联：应用重叠延伸PCR技术，对ASFV病毒结构蛋白P30、P54的编码基因p30、p54和猪Fcγ、Fcα片段进行串联，扩增出p30-Fcγ、p54-Fcα融合片段；

(4)表达质粒的构建：通过BamHI单酶切线性化POT载体，无缝克隆连接p30-Fcγ、p54-Fcα片段至表面展示表达载体pGPD-POT-TU^[1]上，转化至E.coli DH5a中，选取阳性克隆进行菌液验证PCR，测序；

(5)重组表达质粒转化酵母细胞：将构建成功的重组表达质粒命名为pGPD-p30-Fcγ-ADH1-POT、pGPD-p54-Fcα-ADH1-POT，分别转化酿酒酵母感受态细胞制备两种单表达菌株，再利用特异性引物扩增出互补的前后缀以串联两个转录单位，转化酿酒酵母感受态细胞制备一种同时表达两种融合蛋白的串联复合表达菌株，最后进行基因组水平及蛋白水平验证。

8.权利要求1所述蛋白P30-Fcγ、P54-Fcα在制备非洲猪瘟病毒疫苗中或在制备抗非洲猪瘟病毒药物中的应用。